2013 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトＰ２Ｘ４受容体の３次元構造を基盤とした神経障害性疼痛抑制分子の探索
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23390155
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
植田 正 九州大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (90184928)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白石 充典 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (00380527)
田中 宏幸 九州大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (30253470)
阿部 義人 九州大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (60315091)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 抗体 / 蛋白質工学 / 神経障害性疼痛 |
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| Research Abstract |
平成24年度では、ヒトP2X4受容体の細胞外ドメインを試験管内で巻き戻したものを抗原として、自己免疫疾患マウス、P2X4ノックアウトマウスを用いて抗体を作成し、この抗原に結合するモノクローナル抗体18種を得たことを報告した。平成25年度では、ヒトP2X4細胞外ドメインのN末側、C末側からアミノ酸配列を欠損させた蛋白質10種類を調製して、これらのモノクローナル抗体との結合を調べた。ウエスタンプロットの結果、18種類のほとんどはヘッドドメインに結合したが、それ以外のヒトP2X4細胞外の領域に結合するものも見出された。
一方、天然型ヒトP2X4受容体に結合する抗体を探すために以下のような系を構築した。すなわち、ヒトP2X4受容体のC末端側に蛍光蛋白質であるGFPを連結したリコンビナント蛋白質を構築し、培養細胞で発現した。その蛋白質を粗精製してゲルロ過に供した。溶出はGFPの蛍光発光の波長で追跡した。ヒトP2X4は3量体蛋白質で生理活性を持つが、ゲルロ過ではP2X4受容体が3量体を形成している位置に溶出していた。また、生理活性なP2X4は3量体を形成する分子間にATPが結合するが、熱安定性を評価からATP結合型のヒトP2X4受容体が生成していることがわかった。P2X4受容体の細胞内領域に結合する抗体（市販品）存在下で、高分子側にP2X4受容体由来のピークが溶出したことから、この系では、P2X4受容体に結合する抗体を選別できることがわかった。
そこで、昨年度得た抗体存在下で実験を行ったが、いずれもP2X4受容体由来のピークの溶出位置は変化せず、これらの抗体は天然型P2X4受容体に結合しなかった。
以上のことから、本実験で用いた抗原では、天然型ヒトP2X4受容体に結合する抗体を得ることができなかった。しかし、天然型ヒトP2X4受容体に強く結合する抗体をスクリーニングするアッセイ系を構築することができた。このアッセイ系は天然型ヒトP2X4受容体に強く結合する抗体の選別に有益である。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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