2012 Fiscal Year Annual Research Report
関節破壊を制御する転写因子とマイクロＲＮＡの誘導機構とその治療応用
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23390366
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
廣畑 聡 岡山大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (90332791)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
成瀬 恵治 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (40252233)
二宮 善文 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (70126241)
西田 圭一郎 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80284058)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 関節炎 |
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| Research Abstract |
アグリカナーゼ誘導性が確認されているヒト軟骨肉腫由来細胞株（OUMS-27）をサイトカイン（IL-1β、TNFα（各10ng/mL））で下記に示す各時間、刺激を加えた後でリアルタイムPCR法によりmRNA発現を評価した。次にメカニカルストレス刺激による影響を検討した。培養細胞伸展システムを用いて、OUMS-27にさまざまな伸展刺激を加え、転写因子の発現変化を解析した。さらに、ラットOAモデルを作成し、経時的に膝を摘出してアグリカンの分解を検討した。
【結果】転写因子を、刺激後0, 3, 6, 12, 24, 48時間で経時的に検討した。低酸素状況下で働く転写因子であるHIF-2がサイトカイン刺激6時間で刺激前に比べて約4.5倍にmRNAが上昇した。一方、同じく低酸素で働く代表的な転写因子であるHIF-1は3,6,12,24,48時間のいずれでも大きな変動はなく、両者はことなる動態を取ることが明らかとなった。メカニカルストレスでは、単独で10%伸長、0.5Hzの刺激においては、HIF-1, HIF-2とも大きな変動は示さなかった。そこで、次にサイトカイン刺激にメカニカルストレスを上乗せした場合の発現変化について調べた。メカニカルストレスを1.5時間上乗せしたところ、HIF-1, HIF-2ともに、メカニカルストレス追加群で上昇していた。
次に、miR-140の発現変動を検討した。我々の実験系においては、上記サイトカイン刺激によってmiR-140のmRNAは刺激開始1時間後におよそ0.7倍に減少、その後3,6時間でほぼ正常レベルに復し、以後12, 24時間と徐々にmiR-140のmRNAは上昇傾向になることが明らかとなった。
ラットOAモデルにおいて、2、4、６週と経時的に、OASC組織を摘出し、サフラニン-O染色を行ったところ、染色域の減少を認め、軟骨破壊が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
転写因子の検討、ならびにmiroRNAの解析については進んでいる。
microRNAに関しては網羅的解析を実施した。初回の実験ではmicroRNAの保存状態が良好でなく結果が得られなかったが、保存状態に細心の注意を払いながら再度実験を行うことで問題を解決できた。
他のグループから、miR-140はヒトではそれほど大きく変動せず、別のmicroRNAが働いているという報告が最近なされた。このことから、miR-140はヒト由来細胞であるOUMS-27もしくはラットOAモデルにおいてはそれほど重要な働きをしていない可能性も考えられる。したがって、我々が実施したように、microRNAに関する統合的解析は今後の研究にとって極めて重要であると。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度にmicroRNAの発現実験を行うための細胞導入実験を予定している。この分野は日進月歩であり、最新の最適な導入法を採用予定である。したがって、最適な細胞および生体へのmicroRNA導入法を決定し、目的となる重要なmicroRNAの導入実験を行う。用いる細胞はOUMS-27もしくはヒト軟骨細胞、生体としてはラットＯＡモデルを予定しているが、場合によってはこれらの実験系への導入がうまくいかない可能性があり、その場合は対応策としてマウス関節軟骨細胞を用いて、miR-140の導入実験を行うことも計画する。
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