2014 Fiscal Year Annual Research Report
骨格筋細胞内で活性化したカルパイン３のリアルタイム検出システムの開発
| Project/Area Number |
23500477
|
|---|
| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
|---|
Principal Investigator |
尾嶋 孝一 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産草地研究所 畜産物研究領域, 主任研究員 (60415544)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2015-03-31
|
| Keywords | カルパイン / 骨格筋 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では活性化したカルパイン3をリアルタイムで検出する系を構築することを目的としている。本年度は、FRETシステムを利用した活性化カルパイン3の検出システムの至適化を行い、骨格筋細胞内部でカルパイン3が局在するZ線、およびM線にFRETセンサータンパク質が局在できるようにシグナルを付与した。FRETセンサータンパク質を発現するコンストラクトを筋細胞に導入し、培養細胞をイオノフォア処理することでカルパイン3を強制的に活性化させ、FRETセンサータンパク質の蛍光波長シフトの検出を行った。しかし、顕微鏡下においてFRETセンサータンパク質の波長シフトは検出することはきわめて困難であった。蛍光分光計を用いFRETセンサータンパク質の波長シフトは観察されること、イムノブロットによりFRETセンサータンパク質の切断は検出できたことを考慮すると、FRETセンサータンパク質は機能していると考えられるが、細胞内部では発現するFRETセンサータンパク質の量が多いため、カルパイン3がFRETセンサータンパク質を切断してもシグナルが微弱なため検出が難しかったと考えている。
一方、カルパイン3の酵素活性制御機構を研究している過程でカルパイン3がリン酸化修飾を受けていることを見いだした。カルパイン3の酵素活性に与えるリン酸化の影響をさらに追究したところ、629番目のセリン残基をリン酸化されないアラニンに置換した場合、わずかであるがカルパイン3の自己消化活性が減弱することが明らかになり、リン酸化の有無によりカルパイン3の酵素活性が影響することが明らかになった。
|
Research Products
(2 results)
