2013 Fiscal Year Annual Research Report
ウイルスベクターとジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた高効率相同組み換え法の開発
| Project/Area Number |
23500491
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
山口 智之 東京大学, 医科学研究所, 助教 (80392158)
|
|---|
| Keywords | ZFN / TALEN / Cas9/CRISPR / レンチウイルスベクター / 相同組み換え |
|---|
| Research Abstract |
ZFNやTALENとはゲノム上の任意の場所の両側数塩基に特異的に結合できるよう人工的に合成されたDNA結合タンパク とFokI 制限酵素のエンドヌクレアーゼ領域を結合させたキメラヌクレアーゼである。本研究ではHIVインテグラーゼとこれら人工ヌクレアーゼの融合タンパク質をレンチウイルスベクター粒子内に封入し、相同組み換えドナーを組み込んだレンチウイルスベクターがゲノム上の標的領域に挿入されるようなベクターシステムの開発を目標としている。 昨年度までにすでに報告されているOPEN methodによってZFNを作製することに成功したが、その後ZFNよりも活性が強く作製も簡単なTALENが報告された為、こちらを実験に用いた。 インテグラーゼとTALENの融合タンパクのnuclease活性を確認し、レンチウイルスベクターに封入して細胞に感染させたが、標的部位への挿入は確認できなかった。 これはヌクレアーゼの活性に必要な左右二つのヌクレアーゼを効率良くウイルス粒子に取り込めなかった、またはタンパク質でウイルス粒子内に取り込まれたヌクレアーゼは活性が必要十分ではなかったことが原因であると考えられる。
近年Cas9/CRISPRシステムという新しいヌクレアーゼシステムが開発された。 このシステムではタンパク質ではなくRNAが鋳型に結合し、そこに導かれたヌクレアーゼがゲノムを切断する。 このシステムは上記の実験結果を克服できる可能性があると考えた。レンチウイルスベクターにヌクレアーゼであるCas9と鋳型に導くガイドRNAを組み込み、感染させたところ、非常に効率良く標的部位を切断することができた。 このシステムを利用すれば通常の遺伝子導入法では導入困難なPrimaryの細胞にも効率良く変異を導入することができる非常に有意義なシステムである。 現在相同組み換えが可能であるかの検討を行っている。
|
-
[Journal Article] Immortalization of erythroblasts by c-MYC and BCL-XL enables large-scale erythrocyte production from human pluripotent stem cells.2013
Author(s)
Hirose S, Takayama N, Nakamura S, Nagasawa K, Ochi K, Hirata S, Yamazaki S, Yamaguchi T, Otsu M, Sano S, Takahashi N, Sawaguchi A, Ito M, Kato T, Nakauchi H, Eto K.
-
Journal Title
Stem Cell Reports.
Volume: 1
Pages: 499-508
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Recurrent mutations in multiple components of the cohesin complex in myeloid neoplasms.2013
Author(s)
Kon A, Shih LY, Minamino M, Sanada M, Yamaguchi T, Otsu M, Obara N, Sakata-Yanagimoto M, Nakamaki T, Ishiyama K, Nolte F, Hofmann WK, Miyawaki S, Chiba S, Mori H, Nakauchi H, Koeffler HP, Aburatani H, Haferlach T, Shirahige K, Miyano S, Ogawa S.
-
Journal Title
Nat Genet.
Volume: 45
Pages: 1232-1237
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Generation of transgenic mouse line expressing Kusabira Orange throughout body, including erythrocytes, by random segregation of provirus method.2013
Author(s)
Hamanaka S, Ooehara J, Morita Y, Ema H, Takahashi S, Miyawaki A, Otsu M, Yamaguchi T, Onodera M, Nakauchi H.
-
Journal Title
Biochem Biophys Res Commun.
Volume: 435
Pages: 586-591
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs.2013
Author(s)
5. Matsunari H, Nagashima H, Watanabe M, Umeyama K, Nakano K, Nagaya M, Kobayashi T, Yamaguchi T, Sumazaki R, Herzenberg LA, Nakauchi H.
-
Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A.
Volume: 110
Pages: 4557-4562
Peer Reviewed
-
-
-
