マウス遺伝資源の保全に対応した高度生殖工学技術の開発と体細胞核移植技術への応用

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23500506
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 安齋 政幸 近畿大学, 先端技術総合研究所, 講師 (30454630)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: 実験動物学 / 凍結保存 / 生殖工学

Research Abstract

本研究では、卵巣内に存在する未成熟卵子を用いた高度な生殖工学技術の開発を進め、より効率的で実用的である産子作出方法を検討し、さらに動物種間にて卵母細胞内における卵成熟促進因子の活性化機序を探り、卵成熟と発生能を改善することで、実験動物のみならず野生のげっ歯類における生殖細胞や体細胞を対象とした遺伝資源の効率的な保存・増殖方法を検討した。申請者は先ず、近交系マウス由来卵巣内卵子を用いた効率的な受精方法の確立を検討し、体外成熟卵子のレーザー穿孔処理法および媒精時における精子濃度の調整により、体外受精率が向上することを確認した。次に、新たに開発を行う卵巣組織の回収方法を検討し、麻酔下による外科的処置等により動物個体を殺処分することなく一部の卵巣組織のみを低侵襲的に回収し体外成熟操作により効率的な個体の作出方法を開発した。一方、これら体外成熟操作に用いられる体外成熟培地の改良も試み、従来のTaM培地に血清を添加した修正TaM培地を開発し、近交系マウスへの体外成熟および体外受精成績の向上を認めたが初期胚の発生について低率であった。これらの改善のため、体外成熟培地へ卵子の細胞質内運搬経路として密接な関係を示す、L-カルニチンを添加した体外成熟培地を開発し、初期胚の発生向上を確認した。さらに、得られた体外成熟由来卵子からの初期胚作製後における個体作製に係る検討を行ない、凍結保存（ガラス化法）および冷蔵保存（４℃下保存）いずれの操作およびこれらの形態で輸送された胚からの個体作製に成功した。以上の検討結果から、体外成熟卵子の発生能をより現実的に向上させることが期待され、様々な動物種あるいは系統間の特性に応じた繁殖技術を提供し、さらに生殖補助医療分野における、先進的な生殖工学技術を提供できると考えられる。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本申請で述べた研究計画は、マウス卵巣由来未成熟卵子を用いた高度生殖工学技術の開発およびその未成熟卵子の遺伝子発現研究そしてマウス組織由来体細胞株の樹立の３つの要素から構成されている。本研究の実施はいずれも動物実験を伴うが、動物福祉には最大限に配慮し実施されている。各検討課題には、卵巣内に存在する未成熟な卵子を用いた体外成熟方法および受精操作技術の確立を検討し、いずれの検討課題について、体外成熟培地の更なる改良を検討しレーザー穿孔装置による透明帯穿孔法を開発したことで、受精率が向上および初期胚の発生率の向上が明らかとなった。本結果は、日本実験動物技術者協会へ報告した。また、マウスを処分することなく卵巣組織のみを低侵襲的に回収し体外成熟操作により効率的な個体の作出方法を開発し、これらの成果は、日本実験動物学会へ報告するに至っている。体外成熟由来初期胚からの産子作出方法について、凍結保存（ガラス化法）および冷蔵保存（４℃下保存）いずれの操作およびこれらの形態で輸送された胚からの個体作製に成功した。これらの成果は、日本実験動物技術者協会へ報告された。一方、分子遺伝学的手法による卵巣内から回収される未成熟卵子の遺伝子発現がその後の成熟・受精・発生におよぼす影響を検討したところ、体外成熟培地中によるアルブミン添加がその後の胚発生へ与える影響を示すことが明らかとなった。これらの分子遺伝学的技術には単一卵子でのmRNAの可視化が有効であることを認めた。これらの成果は日本分子生物学会へ報告された。以上のことより、いずれも本研究の進展は極めて効率的に機能していると考える。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究課題として、現在まで実施した成果を基に、未成熟卵子を用いた体外成熟後の体外受精時おける様々な形態学的変化マウスの系統差における未成熟卵子からの遺伝子発現制御および時間・空間的転写因子の寄与機構、成熟時における発生制御機構、受精後以降での転写発現機構の制御等の解決を探求する。本計画では、体外成熟卵子を用いて卵細胞質内存在下における種々の発現機構を探求する手段として、免疫組織化学的に検出する非放射性標識プローブを用いたin situ hybridization技術にて、細胞質内におけるRNA存在下蓄積領域の解析を進める。次に、マウス系統差あるいは体外成熟培地における、未成熟卵子の形態学的特性、特に抗酸化作用における細胞質内の動態を観察する。これらのことは、卵子成熟過程における卵子内因子の解析を進め、体外成熟卵子の発生能をより現実的に向上させることが期待され、様々な動物種あるいは系統間の特性に応じた、遺伝子発現制御機構および繁殖技術を提供できると考えられる。また、このように生殖細胞だけを用いた人工繁殖にはすでに限界があり、個体の生殖能力や生殖細胞に依存しない体細胞クローン技術を実用化レベルに向上させることが出来れば、将来、生物多様性の保全に貢献することが期待される。そこで本計画では、実験用マウスを基盤に現有技術で行われている、比較的低侵襲的に回収が可能な組織（尾部・耳部・上皮細胞等）、から体細胞を取得し培養の後、細胞株の樹立を行う。さらに、動物園等から授受される小型げっ歯類にも本技術を応用することにより、天然記念物や展示動物等、容易に研究出来ない動物種からの体細胞樹立を可能にし、その遺伝情報の共有化や細胞バンクの設立等、希少動物の保全に関する研究が加速すると考えられる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

すべて研究計画に添って充当される。高度生殖工学技術の開発においては、胚・配偶子操作に係る細胞培養試薬および器具は研究期間を通じて必要とする。遺伝子発現研究においては、免疫組織学、in situ hybridization、抗酸化活性測定等、発現動態に伴う解析を検討するため、分子生物学研究試薬は研究期間を通じて必要とする。体細胞株の樹立に関しては、細胞培養に係る培養液やウシ胎仔血清等の細胞培養試薬を必要とする。また本申請期間を通じて、実験動物の飼養と管理は不可欠であり、清浄度の高い動物施設管理作業に掛かる飼料および床敷き等の実験動物飼育管理用品経費が必要となる。いずれも本研究の進展に極めて有効的に使用されるものと考える。

Research Products

• [Journal Article] マウス体外成熟由来2細胞期胚を用いた冷蔵輸送・保存方法の検討 (2012)
  • Author(s): 西村愛美,中牟田裕子,福本紀代子,近藤朋子,春口幸恵,竹下由美,土山修治,石川裕子,石束祐太,細井美彦,三谷匡,竹尾透,中潟直己,安齋政幸
  • Journal Title: 近畿大学生物理工学部紀要 Volume: 29 Pages: 33-42
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of Dnmt1p mRNA knock down on Dnmt1 protein translation in mouse testis (2012)
  • Author(s): H. Kato, R. Kitamura, H. Yamaguchi,Y. Numata, T. Kijima, M. Anzai,T. Mitani, K. Matsumoto, K. Saeki,Y. Hosoi, A. Iritani
  • Journal Title: Reprod. Fertil. Dev. Volume: 24 Pages: 202
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transport of 2-cell embryos produced by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) at cold temperatures (4℃) (2011)
  • Author(s): Manami Nishimura, Kiyoko Fukumoto, Yuko Nakamuta, Yoshihiko Hosoi, Toru Takeo, Naomi Nakagata and Masayuki Anzai
  • Journal Title: 近畿大学生物理工学部紀要 Volume: 28 Pages: 109-116
  • Peer Reviewed
• [Presentation] アミノ酸添加培地を用いたマウス体外成熟由来初期胚発生の検討 (2012)
  • Author(s): 松浦悟,西村愛美,石束祐太,杉本奈央,北原直弥,松崎ひかる,東雅志,細井美彦,安齋政幸
  • Organizer: 日本実験動物技術者協会関西支部平成23年度春季大会総会
  • Place of Presentation: 兵庫（神戸学院大学）
  • Year and Date: 2012年3月10日
• [Presentation] Effect of Dnmt1p mRNA knock down on Dnmt1 protein translation in mouse testis (2012)
  • Author(s): H. Kato, R. Kitamura, H. Yamaguchi,Y. Numata, T. Kijima, M. Anzai,T. Mitani, K. Matsumoto, K. Saeki,Y. Hosoi, A. Iritani
  • Organizer: International Embryo Transfer Society, 27th Annual Conference
  • Place of Presentation: アメリカ（フェニックス）
  • Year and Date: 2012年1月8－10日
• [Presentation] 顕微授精により作出したマウス2細胞期胚の低温輸送に関する研究 (2011)
  • Author(s): 西村愛美,福本紀代子,近藤朋子,春口幸恵,竹下由美,中牟田裕子,土山修治,細井美彦,竹尾透,中潟直己,安齋政幸
  • Organizer: 第29回日本受精着床学会・学術講演会
  • Place of Presentation: 東京（京王プラザホテル）
  • Year and Date: 2011年9月9日～10日
• [Presentation] マウスES細胞クローン卵子におけるクロマチンリモデリング因子ならびにヒストンバリアントの動態とその人為制御 (2011)
  • Author(s): 石川裕子、西山有依、川口翔、平野大起、加藤博己、安齋政幸、入谷明、細井美彦、三谷匡.
  • Organizer: 第29回日本受精着床学会・学術講演会
  • Place of Presentation: 東京（京王プラザホテル）
  • Year and Date: 2011年9月9日～10日
• [Presentation] マウス体外成熟卵子からの体外受精由来2細胞期胚の冷蔵輸送に関する試み (2011)
  • Author(s): 西村愛美,中牟田裕子,福本紀代子,近藤朋子,春口幸恵,竹下由美,土山修治,細井美彦,竹尾透,中潟直己,安齋政幸
  • Organizer: 第45回日本実験動物技術者協会総会
  • Place of Presentation: 岩手（盛岡市民文化ホール）
  • Year and Date: 2011年9月30日～10月1日
• [Presentation] 卵巣内卵子の有効利用を目的とした低侵襲的卵巣回収および未成熟卵子発生能の検討 (2011)
  • Author(s): 西村愛美,宮下実,中川隆生,石束祐太,平野大起,三谷匡,加藤博己,細井美彦,安齋政幸
  • Organizer: 第58回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 東京（タワーホール船堀）
  • Year and Date: 2011年5月25日～27日
• [Presentation] Nuclear dynamics in chromosome territories and gene loci under in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. (2011)
  • Author(s): Kawaguchi S, Hirano D, Hosoi Y, Anzai M, Tanabe H, Mitani T.
  • Organizer: 第44回日本発生生物学会年会、沖縄（Asia-Pacific Developmental Biology Network共催）
  • Place of Presentation: 沖縄（沖縄コンベンションセンター）
  • Year and Date: 2011年5月18日－21日
• [Presentation] Non-B DNA segment promotes high and stable transcription activity of the transgene in mouse embryonic stem cells. (2011)
  • Author(s): Hirano D, Kawaguchi S,Tanase J, Hosoi Y, Anzai M, Ohyama T, Mitani T.
  • Organizer: 第44回日本発生生物学会年会、沖縄（Asia-Pacific Developmental Biology Network共催）
  • Place of Presentation: 沖縄（沖縄コンベンションセンター）
  • Year and Date: 2011年5月18日－21日
• [Presentation] 近交系マウス体外成熟卵子を用いた産子作出方法の改善と母性制御機構が発生に与える影響 (2011)
  • Author(s): 西村愛美,石束祐太,松浦悟,杉本奈央,石川裕子,三谷匡,細井美彦,安齋政幸
  • Organizer: 第26回動物生殖工学研究会
  • Place of Presentation: 東京（北里大学）
  • Year and Date: 2011年12月4日
• [Presentation] Establishment of in situ hybridization technique with mouse single ovum using QuantiGene ViewRNA (2011)
  • Author(s): Manami Nishimura, Yuuta Ishizuka, Satoru Matsuura, Masashi Azuma, Yoshihiko Hosoi, Masayuki Anzai
  • Organizer: 第34回日本分生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2011年12月13日～16日
• [Presentation] DNA extraction from wild mice using supervoltage extraction system Baro Cycler (2011)
  • Author(s): Nao Sugimoto ,Manami Nishimura, Hitoshi Murai, Yuuta Ishizuka, Minoru Miyashita, Hiromi Kato, Yoshihiko Hosoi, Masayuki Anzai
  • Organizer: 第34回日本分生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2011年12月13日～16日