マウス遺伝資源の保全に対応した高度生殖工学技術の開発と体細胞核移植技術への応用

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23500506
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 安齋 政幸 近畿大学, 先端技術総合研究所, 講師 (30454630)
• Keywords: 実験動物学 / 凍結保存 / 生殖工学

Research Abstract

本研究課題として、昨年度実績に基づき引き続き実験動物としてマウスを供試し、卵巣内から回収した卵子（未成熟卵子）を用いて、体外成熟操作により発生した卵子（Ｍ2期）を、高度生殖工学技術を駆使して効率的な受精卵の作出および産子獲得方法を検討した。また、卵子成熟操作に掛かるin vitro系における培地の改良を施すことで卵子形態のみならず細胞質内の活性化維持におよぼす効果を検討し、卵子成熟と受精後の発生能の改善を検討した。さらに遺伝子資源の保存を目的に、野生小型げっ歯類を供試し、実験動物種で確立されている体細胞の取得および体細胞核移植技術による細胞機能の検定をおこない遺伝資源の効率的な保存・増殖方法を検討した。
申請者は、昨年報告した5％血清添加修正TaM培地の改良を進め、L-カルニチン添加修正TaM培地を開発し体外成熟後の体外受精および初期胚発生の向上を示し、血清代替をおこなうことで、体外成熟由来卵子の発生率改善が期待できることを示した。今回、血清代替として高純度アルブミン添加修正TaM培地を開発し、体外成熟操作および体外受精とその後の発生能を検討した結果、受精後の胚盤胞期への発生が向上することを確認した。また、それら体外成熟卵子の動態をGDF9因子にて観察した結果、早期の遺伝子発現低下を抑制していることを示した。
次に、遺伝子資源の保存に有効な手段として生殖細胞の保存と合い並び体細胞の保存技術の確立も有効である。特に野生動物では個体数の減少から低侵襲的な方法が望まれる。申請者は、野生小型げっ歯類を供試して体細胞の樹立を検討し、細胞ストックおよび機能解析をおこなった。さらに得られた体細胞ストックは、体細胞核移植により再構築卵子を作成し活性化処理後、クローン胚の発生に成功した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本申請で述べた研究計画では、マウス卵巣由来未成熟卵子を用いた高度生殖工学技術の開発およびそれら未成熟卵子の遺伝子発現動態の研究そしてマウス組織由来体細胞株の樹立の3要素から構成されている。本研究の実施に際しては、いずれも動物実験を伴うが、動物福祉には最大限に配慮し実施されている。
各検討課題の詳細は、先ず卵巣内未成熟卵子のを用いた受精卵の作成技術の構築として当該年度はマウス凍結精子を用いて体外成熟卵子との体外受精および初期胚発生能を検討した結果、先に開発した透明帯穿孔処理とGSH添加したmHTF培地の開発により新たな高度生殖工学技術の開発を進め、受精卵の作出および産子発生に成功した。
一方、体外成熟培地の更なる改良を進めており、血清代替として高純度アルブミンを添加した修正TaM培地を開発し初期胚の発生率の向上を示すと共に卵子細胞質内における成熟因子としてGDF9因子の早期発現低下を抑制していることを明らかにした。これらの成果は、実験動物科学技術2012および日本受精着床学会へ報告された。
マウス遺伝資源の保全に対応した有用なな手段として、体細胞の保存技術の確立も有効である。申請者は、野生小型げっ歯類を供試して体細胞の樹立をおこない、低温保存により得られた体細胞を組織学的に解析し、染色体数およびDNAシーケンスによる相同性の確認により正常であることを認めた。次に体細胞核移植により体細胞の機能性を確認した結果、電気融合法により再構築されたクローン胚の作成に成功し、得られたクローン胚を同様に解析したことろ、DNAシーケンスによる相同性を単一クローン胚で示された。これらの成果は、日本実験動物技術者協会および日本分子生物学会にて報告された。以上のことより、いずれも本研究の進展は極めて効率的に機能していると考える。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究推進の方策として、現在まで明らかとなった成果を踏まえて、卵巣内卵子の有効利用を目的に、未成熟卵子の体外成熟操作および体外成熟培地がその後の発生にあたえる影響を検討する。さらに、成熟卵子が精子との受精により分化全能性を持つ受精卵の遺伝子発現制御機構にあたえる影響を探求する。
本計画では、既に体外成熟卵子を用いてin situ hybridizationおよびReal-time PCRを用いた細胞質内における蓄積領域の定量化に成功した。今後、新たに卵子細胞質ダメージの指標として酸化ストレス暴露の定量化を比較検討する。現在、開発した高純度アルブミン添加修正TaM培地を用いて発生した卵子を検査したところ酸化抑制の傾向を認めている。これらのことは、更なる体外成熟培地改善に繋がることが期待され、様々な系統への体外成熟-体外受精の応用が期待できる。
体外での胚操作技術には、酸化ダメージに対する卵子の老化および細胞質の活性低下を招く。そこで本計画では、体外成熟由来卵子を用いて体外受精後に受精しない卵子からの高度生殖工学技術を用いた受精卵の作出を検討する。さらにマウス卵子の老化を抑制する披見物質を併用した受精卵の作出を検討する。これらのことは、貴重な卵子を用いたより多くの受精卵を獲得することが可能と考えられ、遺伝資源の保全と確保の観点からも有用な知見が得られると考えられる。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

すべて研究計画に沿って充当される。高度生殖工学技術の開発においては、胚・配偶子の操作に掛かる細胞培養試薬および胚・配偶子培養器具は研究期間を通じて必要とする。
卵子老化抑制剤あるいは酸化ダメージ測定等、卵子細胞質内の発現動態解析に必要な分子生物学研究試薬は研究期間を通じて必要となる。
本申請期間を通じて実験動物の飼養と管理は不可欠であり、清浄度の高い動物実験施設管理作業に掛かる実験動物飼育管理用品経費が必要となる。いずれも本研究の進展に極めて有効的に使用されるものと考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Mouse zygote-specific proteasome assembly chaperone important for maternal-to-zygotic transition. (2013)
  • Author(s): Shin SW, Shimizu N, Tokoro M, Nishikawa S, Hatanaka Y, Anzai M, Hamazaki J, Kishigami S, Saeki K, Hosoi Y, Iritani A, Murata S, Matsumoto K.
  • Journal Title: Biol Open Volume: 15 Pages: 170-82
  • DOI: ONLINE ISSN: 2046-6390
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] L-カルニチン添加体外成熟培地がマウス未成熟卵子由来初期胚の発生に与える影響 (2012)
  • Author(s): 松浦悟, 西村愛美, 石束祐太, 杉本奈央, 中家雅隆, 東雅志, 三谷匡, 細井美彦, 安齋政幸
  • Journal Title: 近畿大学先端技術総合研究所紀要 Volume: 17 Pages: 9-16
  • URL: http://kurepo.clib.kindai.ac.jp/
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of interspecies cloned embryos reconstructed with rabbit (Oryctolagus cuniculus) oocytes and cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) fibroblast cell nuclei. (2012)
  • Author(s): Yamochi T, Kida Y, Oh N, Ohta S, Amano T, Anzai M, Kato H, Kishigami S,Mitani T, Matsumoto K, Saeki K, Takenoshita M, Iritani A, Hosoi Y.
  • Journal Title: Zygote Volume: 5 Pages: 1-9
  • DOI: DOI: http://dx.doi.org/10.1017/S0967199412000019 (About DOI),
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 外科的処置によるし低侵襲的卵巣回収方法および得られた未成熟卵子発生能の検討 (2012)
  • Author(s): 西村愛美、石束祐太、杉本奈央、中家雅隆、中川隆生、東雅志、村井仁志、宮下実、三谷匡、細井美彦、安齋政幸
  • Journal Title: 近畿大学先端技術総合研究所紀要 Volume: 17 Pages: 1-8
  • DOI: ISSN 1346-8693
• [Journal Article] Method for providing an availability of solutions for culture and vitrification of rat embryos (2012)
  • Author(s): M.Yanagi, T.Kamisako, T.Aoto, M.Anzai, T.Kaneko, M.Goto, Y.Sotomaru, A.Takizawa, H.J.Jacob, T.Kawabe, R.Tsuneyoshi, M.Azuma, T.Kuramochi, T.Eto
  • Journal Title: Exprimental Animals Volume: 61 Pages: 250
  • DOI: ONLINE ISSN: 1881-7122
• [Journal Article] Effect of reduced glutathione addition on the fertilization of in vitro matured C57BL/6 oocytes (2012)
  • Author(s): M.Anzai, Y.Ishizuka, M.Nishimura, S.Matsuura, N.Sugimoto, M.Azuma, N.Nakagata, Y.Hosoi
  • Journal Title: Exprimental Animals Volume: 61 Pages: 355
  • DOI: ONLINE ISSN: 1881-7122
• [Journal Article] Effect of embryo development using in vitro matured oocytes by addition of ALBMAX to mature medium (2012)
  • Author(s): M.Nishimura, Y.Ishizuma, S.Matsuura, N.Sugimoto, Y.Tanoue, M.Anzuma, Y.Hosoi, N.Nakagata, M.Anzai
  • Journal Title: Exprimental Animals Volume: 61 Pages: 356
  • DOI: ONLINE ISSN: 1881-7122
• [Presentation] マウス体外成熟培地への各アルブミン類の添加がその後の細胞質のクオリティーに与える影響 (2013)
  • Author(s): 安齋政幸、北原直弥、松崎ひかる、坂山浩彬、筒井れな、細井美彦
  • Organizer: 日本実験動物技術者協会関東支部第38回懇話会
  • Place of Presentation: 国立がん研究センター（東京都）
  • Year and Date: 20130302-20130302
• [Presentation] Study on Conservation of genetic resources using wild mouse (2012)
  • Author(s): Anzai.M, Matsuzaki.H, Murai.H, Kitahara.N, Nishimura.M, Nakagata.N, Sakayama.H, Tsutsui.R, Sugimoto.N, Miyashita.M, Hosoi.Y
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場、マリンメッセ福岡(福岡県）
  • Year and Date: 20121211-20121214
• [Presentation] Examined of wild mouse(Apodemus Speciosus) genetic resources preservation (2012)
  • Author(s): Matsuzaki.H, Murai.H, Kitahara.N, Nakaya.M, Sakayama.H, Tsutsui.R, Miyashita.M, Hosoi.Y. Anzai.M
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場、マリンメッセ福岡(福岡県）
  • Year and Date: 20121211-20121214
• [Presentation] The effect of Trichostacin A on the dynamics of histone H2A variants in mouse somatic cell nuclear transfer embryos (2012)
  • Author(s): Nakaya.M, Emoto.T, Kawaguchi.S, Takatu,H, Anzai.M, Hosoi.Y, Harata.M, Mitani.T
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場、マリンメッセ福岡(福岡県）
  • Year and Date: 20121211-20121214
• [Presentation] Effects of intracellular reactive oxygen species generation and developed of immature mouse oocytes were additon medium of high purity albumin (2012)
  • Author(s): Kitahara.N, Nishimura.M, Matsuzaki.H, Azuma M, Sakayama.H, Tsutsui.R, Nakagata N, Hosoi.Y. Anzai.M
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場、マリンメッセ福岡(福岡県）
  • Year and Date: 20121211-20121214
• [Presentation] 当施設における野生マウス由来繊維芽細胞の樹立による遺伝資源保存技術の試み (2012)
  • Author(s): 安齋政幸、松崎ひかる、村井仁志、北原直弥、中家雅隆、東雅志、宮下実、細井美彦
  • Organizer: 日本実験動物技術者協会関西支部秋季岡山大会
  • Place of Presentation: 川崎医科大学（岡山県）
  • Year and Date: 20121117-20121117
• [Presentation] GSEは受精直後の胚における能動的脱メチル化に関与している (2012)
  • Author(s): 畑中勇輝、守田昂太郎、清水なつみ、西村愛美、西川慧、西原卓志、加藤理恵、武本淳史、天野朋子、安齋政幸、岸上哲士、佐伯和弘、細井美彦、松本和也
  • Organizer: 第30回日本受精着床学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場（大阪府）
  • Year and Date: 20120830-20120831
• [Presentation] マウス体細胞核移植卵子におけるヒストンH2A.Zの動態に及ぼすトリコスタチンAの影響 (2012)
  • Author(s): 石川裕子、恵本哲矢、中家雅隆、川口翔、平野大起、加藤博己、安齋政幸、岸上哲士、入谷明、細井美彦、福田愛作、森本義晴、三谷匡
  • Organizer: 第30回日本受精着床学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場（大阪府）
  • Year and Date: 20120830-20120831
• [Presentation] L-カルニチン添加体外成熟培地を用いたマウス未成熟卵子由来初期胚が発生に与える影響 (2012)
  • Author(s): 北原直弥、松浦悟、杉本奈央、松崎ひかる、東雅志、中家雅隆、三谷匡、細井美彦、安齋政幸
  • Organizer: 第30回日本受精着床学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場（大阪府）
  • Year and Date: 20120830-20120831
• [Presentation] 体外成熟培地内へのALBUMAX添加が未成熟卵子の成熟改定における母性発現因子に与える影響 (2012)
  • Author(s): 安齋政幸、西村愛美、北原直弥、松崎ひかる、東雅志、酒井峻、加藤博己、中潟直己、細井美彦
  • Organizer: 第30回日本受精着床学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場（大阪府）
  • Year and Date: 20120830-20120831
• [Presentation] マウス体外成熟由来初期胚におけるアミノ酸添加がその後の胚発生に与える影響 (2012)
  • Author(s): 松崎ひかる、松浦悟、杉本奈央、北原直弥、中家雅隆、東雅志、三谷匡、細井美彦、安齋政幸
  • Organizer: 第30回日本受精着床学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場（大阪府）
  • Year and Date: 20120830-20120831
• [Presentation] 体外成熟培地へのALBUMAXの添加による体外成熟胚の胚発生への影響 (2012)
  • Author(s): 西村愛美、石束祐太、松浦悟、杉本奈央、 田上友貴、東雅志、 細井美彦、中潟直己、安齋政幸
  • Organizer: 第59回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 別府国際コンベンションセンター(大分県）
  • Year and Date: 20120524-20120526
• [Presentation] C57BL/6未成熟卵子を用いた同系統凍結精子において受精培地にグルタチオン添加がもたらす効果 (2012)
  • Author(s): 石束祐太、西村愛美、松浦悟、杉本奈央、東雅志、細井美彦、中潟直己、安齋政幸
  • Organizer: 第59回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 別府国際コンベンションセンター(大分県）
  • Year and Date: 20120524-20120526
• [Presentation] ラット初期胚を用いた体外培養培地およびガラス化保存液の安定供給の検討 (2012)
  • Author(s): 柳美穂、上迫努、青砥利裕、安齋政幸、金子武人、後藤元人、外丸祐介、滝沢明子、Jacob Howard J、川辺敏晃、常吉梨沙、東雅志、倉持隆司、江藤智生
  • Organizer: 第59回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 別府国際コンベンションセンター(大分県）
  • Year and Date: 20120524-20120526
• [Presentation] C57BL/6未成熟卵子を用いた受精培地にグルタチオン添加がその後の発生に与える影響 (2012)
  • Author(s): 安齋政幸、石束祐太、西村愛美、松浦悟、杉本奈央、東雅志、中潟直己、細井美彦
  • Organizer: 第59回日本実験動物学会総会
  • Place of Presentation: 別府国際コンベンションセンター(大分県）
  • Year and Date: 20120524-20120526