2011 Fiscal Year Research-status Report
ＤＮＡ損傷応答シグナルネットワークにおけるＴＩＰ６０複合体のダイナミクス
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23510061
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
井倉 毅 京都大学, 放射線生物研究センター, 准教授 (70335686)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体 / ヒストンH2AX / ブロモドメイン蛋白質 / アセチル化 |
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| Research Abstract |
電離放射線によるDNA損傷に伴うDNA損傷応答シグナルは、センサー蛋白質のクロマチンとの結合によって活性化されるが、損傷領域のクロマチンの構造変化が、DNA損傷応答シグナルの活性化にどのように関与するのかは不明な点が多い。申請者らは、TIP60ヒストンアセチル化酵素によるヒストンH2AXのクロマチンからの放出が、DNA損傷応答初期シグナルの活性化に関与していることを明らかにした。しかしながらTIP60が如何なる機構でDNA損傷領域に誘導、維持され、H2AXのクロマチンからの放出を促すのかについては未だ不明である。本課題では、TIP60複合体の構成因子であり、ヒストンのアセチル化に結合するブロモドメイン蛋白質BRDXに着目し、TIP60複合体が、如何にDNA損傷部位に集積するのかを明らかにし、ヒストンH2AXのアセチル化を介した、DNA損傷応答シグナル活性化の分子機構を解明する。BRDXは、TIP60と安定に複合体（DNA損傷の有無に寄らず、常に両者は結合している）を形成しており、BRDXがTIP60のDNA損傷領域への誘導、維持に関与することが予想された。本年度は、BRDXのDNA損傷部位への集積をMicro-irradiation法を用いて検討した。GFP-BRDXを安定に発現するU2OS細胞を作成し、その安定発現細胞株を用いて、Micro-irradiation法によってGFP-BRDXのDNA損傷部位への集積を検討した結果、GFP-BRDXは、DNA損傷部位に集積することが明らかになった。この実験結果をさらにBRDXの抗体を用いてクロマチン免疫沈降法でBRDＸが、I-Sce1で切断されたDNA損傷領域に集積するか否かについて検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNA損傷の有無に関わらず、TIP60ヒストンアセチル化酵素と安定な複合体を形成しているブロモドメイン蛋白質BRDXが、DNA損傷領域に誘導されることがmicro-irradition法によって明らかにされたことは進歩であるが、I-Sce1によるクロマチン免疫沈降法での検証に時間を要している。その理由としてクロマチン免疫沈降法の系の条件検討（I-Sce1のアデノウイルスを作製して、そのウイルスをI-Sce1の切断サイトを導入したHela細胞に感染させているが、そのタイター、感染時間など）に時間を要したことが原因である。現在ではそれらの条件検討が完了し、実験そのものは順調に進んでいる。BRDXが、TIP60ヒストンアセチル化酵素のDNA損傷領域への誘導に関与しているか否かについてもBRDXのsiRNAを導入した細胞でGFP-TIP60を安定に発現する細胞株を作製し、Micro-irradiationによって本年度中にGFP-TIP60のDNA損傷部位への集積にBRDXが必要かどうかを検討する予定であったが、BRDXのsiRNAの導入によるノックダウン効果があまり良くなく、現在は、異なるターゲット配列によるBRDXのノックダウン細胞を新たに作製し、現在検討をしている。これらの理由により当初の予定よりも若干の遅れはあるが、実験そのものは順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成24年度は、BRDXがTIP60によるH2AXのクロマチンからの放出に関与しているか否かについて検討するが、この点は、すでにiFRAP実験が順調に稼働しており問題はない。またBRDXは、TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体の構成因子であり、仮に当初の仮説通りにBRDXが、TIP60ヒストンアセチル化酵素のDNA損傷部位への誘導に関与していることが明らかになり、実験計画どおり、ヒストンH4のアセチル化の増幅に関与していることが明らかになったとしてもその分子機構は不明である。そこで次なる課題としてBRDX が如何なる機構でTIP60のDNA損傷部位へ誘導を制御しているかについて取り組む必要があるが、これまでの我々の研究結果や他のグループの解析により、BRDXがアセチル化されることを突き止めており、このBRDXのアセチル化修飾がTIP60あるいはBRDXのDNA損傷部位への誘導に関与していることが考えられる。この点を平成24年度の研究項目に付け加える必要があるであろう。その他に本課題の研究計画遂行にあたり特に大きな問題点ない。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度研究計画は、バイオイメージング、クロマチン免疫沈降法、蛋白質複合体のプロテオミクス解析などを用いてBRDXのDNA損傷応答シグナルでの役割を検討するが、必要な経費は、ノックダウン細胞の作製に用いるsiRNAの作製費用、クロマチン免疫沈降法に用いる市販の抗体の購入あるいは抗体作製（必要に応じて）費用、蛋白質複合体のプロテオミクス解析を行うための細胞大量培養に必要な血清を始めとする培養試薬などが上げられる。さらに最終年度であることもあり、これまでに得られた研究成果を論文あるいは学会発表などに本年度の予算を使用する予定である。
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[Journal Article] Purification of the human SMN-GEMIN2 complex and assessment of its stimulation of RAD51-mediated DNA recombination reactions2011
Author(s)
Takaku, M., Tsujita, T., Horikoshi, N., Takizawa, Y., Qing, Y., Hirota, K., Ikura, M., Ikura, T., Takeda, S., Kurumizaka, H
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Journal Title
Biochemistry
Volume: 50
Pages: 6797-6805
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