難培養微生物用新規バルブレス一菌体分離・ゲノム増幅マイクロ流体チップの開発

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23510139
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 青木 弘良 独立行政法人理化学研究所, 光量子工学研究領域, 研究員 (50518636)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池 郁生 独立行政法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任研究員 (40183157) ; 新谷 政己 国立大学法人 静岡大学, 工学部, 准教授 (20572647)
• Keywords: マイクロ流路 / ナノファイバー / 一菌体ゲノム増幅 / 難培養微生物

Research Abstract

１．ゲノムDNA分離用ポリビニルブチラール・ナノファイバー膜(PVB-NF)の作製
マイクロ流路内で目視で分離した微生物を保持し，抽出したゲノムDNAを保持するための，PVB-NF(繊維径 80 nm, 孔径 300 nm)の評価を行った．濾紙上に0.14 mg/mLのPVB-NFを固定化し濾過を試みたが，微細な線維のため破損しやすく，安定した濾過は困難だった． またアルカリにより断片化したゲノムDNAを分離するためには，より小さい孔径が求められた．
２． アルギン酸マイクロビーズの作製
酸性多糖類のアルギン酸は，Ca2+により容易に孔径60-nmのゲルを形成する．そこで菌体のアルギン酸ゲルビーズ内への包埋により，ビーズ内でのゲノムDNAの保持，環境由来DNAのコンタミ防止および分離操作性の向上を図った．菌体を包埋したアルギン酸ビーズは，試薬の拡散促進のため，微細化が重要である．従来アルギン酸ゲルは粘度が高く，100 μm径以下のビーズは困難だったが，エレクトロスピニングにより8.5 μm径のビーズを作製できた．さらに表面にアミノ基を導入した4.5μmポリエチレンフィルム上に大腸菌を添加したアルギン酸をエレクトロスピニングし，架橋することで，フィルム上に固定化し，レーザーマイクロダイセクション (LMD, Leica) で，目的の菌体の切断と分離ができた．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の目的は，環境中の難培養微生物を目視で分離し，微小空間内でゲノム増幅することにより，増幅バイアスの少ないゲノムDNAを得ることである．これまでは一菌体分離のためのシステムの構築の技術上の課題から解決に時間を要した．昨年度はエレクトロスピニングによるアルギン酸ビーズとLMDによる切り出しにより，一菌体分離をより簡便に実現でき，大きく前進した．本年度は分離した菌体をアルギン酸ビーズ内，もしくはマイクロ流路内の微小空間内で酵素増幅し，定量PCRによって増幅バイアスの変化を検証したい．

Strategy for Future Research Activity

本実験は，単離した菌体を，アルギン酸ビーズ内に包埋したまま，アルカリ処理によりゲノムDNAを抽出した後，酵素増幅によりゲノムDNAを増幅する．その際の課題は，アルカリやバッファいー中の塩に対するアルギン酸ゲルの安定性と，酵素増幅時の反応液量の制御である．イオン結合性のアルギン酸ゲルは，濃い塩や強アルカリ下で分子が解離し，ゲルが溶解するおそれがある．この場合架橋剤によるアルギン酸ゲルの不溶化や，耐塩性の温度依存性ゲルである，アガロース，ゼラチン，メチルセルロースなどを検討する．また10 μm径程度のアルギン酸ゲルは非常に微小なため(1- pL)，増幅量を増やすため，反応液量を増やす必要がある．この方法として，ゲノムDNAと酵素溶液とのマイクロエマルジョン(数百μm程度, 1 nL-)を作る方法があるが，エマルジョンサイズが不均一である．そこでマイクロ流路を用い，均一な反応溶液系を構築する．

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

実験進捗の遅れにより未使用分が生じたが，全額本年度の実験の推進に利用することで，有効に予算を使用したい．
ゲル化試薬，ゲノムDNA酵素増幅，および増幅バイアスを評価するためのプライマーおよび試薬の購入に充当する．