光駆動型イオンポンプ：ハロロドプシンのクロライド輸送素過程の解明

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23510251
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 菊川 峰志 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 助教 (20281842)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮内 正二 東邦大学, 薬学部, 教授 (30202352)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: ハロロドプシン / イオンポンプ / レチナール / フォトサイクル

Research Abstract

高度好塩菌の細胞膜に存在するハロロドプシン（HR)は、光エネルギーを用いて、Cl-を細胞外から細胞内へ輸送する蛋白質である。光で活性化できるという利点に加え、輸送活性などの測定手法の確立によって、HRは輸送分子機構を詳細に解析できる優れたモデル蛋白質となってきている。本研究では、輸送に伴う分子内イベントの解析と、そこに係わる重要アミノ酸残基の同定を通して、HRの分子機構を考察する。今年度は、以下の二つの成果を得た。１．HRが光反応サイクル中に発生する起電力の時間分解測定：誘電性薄膜であるコロジオン膜にHRを吸着させ、この膜を用いた電気化学セルを構築した。誘電性薄膜はコンデンサ、HRは電池とみなせるため、Cl-輸送に伴う輸送起電力は、光誘導電流として観測される。電気化学セルにナノ秒パルスレーザを照射したところ、数ミリ秒で最大となる誘導電流を観測した。これは、光反応サイクルにおけるO中間体の生成・崩壊のタイミングとほぼ一致しており、この中間体の前後で、Cl-の長距離の移動が起こることが示唆された。２．H.salinarum由来のHR（HsHR）の大腸菌発現系を用いた調製法の確立：HRの研究には、HsHRとN.pharaonis由来のHR（NpHR）が主に用いられてきた。両者には、輸送基質の種類や光反応サイクルなど、興味深い違いがあることが知られており、これらを比較することで、Cl-輸送機構をより詳細に検討できるものと期待される。NpHRは、大腸菌における機能的大量発現系が確立しているが、HsHRでは、これがなかった。そこで、HsHRの大腸菌発現系を用いた調製を試みた。その結果、HsHRは、不活性な状態で大腸菌膜に発現するが、可溶化時にレチナールを添加することで、活性型のHsHRを得られることが明らかとなった。この手法によって、HsHR変異体を容易に調製できるようになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、目的達成のための具体的な研究項目として、以下の３点を設定している。（１）各輸送中間体で起こる分子内イベントを明らかとする。（２）輸送に伴う構造変化を検出し、それらが起こる輸送中間体を決定する。（３）種々の変異体を作成し、輸送駆動力とイオン透過能に関与する残基を同定する。今年度は、（１）の研究項目を推進するために、HRが発生する輸送起電力の時間分解測定を行い、Cl-の放出が起こる反応中間体を推定することが出来た。同じく（１）の推進のために、好塩菌膜ベシクルに過渡吸収分光法を適用して、輸送素過程を解析することも予定していたが、この測定は、準備段階に留まり、次年度以降の課題となった。一方、これに代わって、H. salinarumのHRを、大腸菌発現系を用いて調製する方法を確立させることが出来た。これは、（３）の研究項目に該当し、今後、種々の変異体を容易に作成し、解析に用いることが可能となった。

Strategy for Future Research Activity

「現在までの達成度」欄に記載したとおり、本研究では、３点の具体的な研究項目を設定している。それぞれの研究項目について、以下の測定を行う予定である。（１）各輸送中間体で起こる分子内イベントを明らかとする：Cl-の放出、あるいは、取込みが起こる輸送中間体の崩壊速度は、細胞質側、細胞外側のCl-濃度や、膜電位に依存すると考えられる。これらの条件を設定した好塩菌膜ベシクルを調製し、過渡吸収分光測定を行い、輸送素過程を解析する。今年度は、膜ベシクルの調製法を検討した。来年度以降に分光測定を行う。（２）輸送に伴う構造変化を検出し、それらが起こる輸送中間体を決定する：構造変化によって、HRの親水的、あるいは疎水的な部分が露出される様子を、その部位への化学物質の流入あるいは化学的な結合として検出する。（３）種々の変異体を作成し、輸送駆動力とイオン透過能に関与する残基を同定する：アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的な測定を行う。既に報告されているHRの結晶構造を参考として、多数の変異体を作成し、輸送に重要な残基を特定する。輸送活性の膜電位依存性を測定し、変異体の「輸送駆動力」と「イオン透過能」を別々に定量する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

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Research Products

• [Journal Article] Photo-induced Bleaching of Sensory Rhodopsin II (Phoborhodopsin) from Halobacterium salinarum by Hydroxylamine: Identification of the Responsible Intermediates, (2012)
  • Author(s): Tamogami, J., Kikukawa, T., Ikeda, Y., Demura, M., Nara, T., Kamo, N.
  • Journal Title: J. Photochem. Photobiol. B Volume: 106 Pages: 87-94
  • DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2011.10.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Photochemistry of Acetabularia Rhodopsin II from a Marine Plant, Acetabularia acetabulum (2011)
  • Author(s): Kikukawa, T., Shimono, K., Tamogami, J., Miyauchi, S., Kim, S., Kimura-Someya, T., Shirouzu, M., Jung, K.-H., Yokoyama, S., Kamo, N.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 50 Pages: 8888-8898
  • DOI: 10.1021/bi2009932
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Expression of salinarum halorhodopsin in Escherichia coli cells: solubilization in the presence of retinal yields the natural state (2011)
  • Author(s): Yamashita, Y., Kikukawa, T., Tsukamoto, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Kawano, K., Miyauchi, S., Kamo, N., Demura, M.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta Volume: 1808 Pages: 2905-2912
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2011.08.035
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of the eukaryotic light-driven proton pumping rhodopsin, Acetabularia rhodopsin II, from marine alga (2011)
  • Author(s): Wada, T., Shimono, K., Kikukawa, T., Hato, M., Shinya, N. Kim, S-Y., Kimura-Someya, T., Shirouzu, M., Tamogami, J., Miyauchi, S., Jung, K-W., Kamo, N., Yokoyama, S.
  • Journal Title: J. Mol. Biol. Volume: 411 Pages: 986-998
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2011.06.028
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 海洋細菌由来のロドプシン様タンパク質プロテオロドプシンの低pH条件下における速いプロトン放出機構
  • Author(s): 田母神淳，菊川峰志，下野和実，奈良敏文，宗行英朗，加茂直樹
  • Organizer: 日本薬学会第132年会
  • Place of Presentation: 北海道大学（札幌市）
  • Year and Date: 平成24年3月30日
• [Presentation] 短鎖リン脂質ジヘプタノイルホスファチジルコリンミセル中の膜タンパク質バクテリオロドプシンの不均一性
  • Author(s): 桑原由美子，菊川峰志，出村誠，園山正史
  • Organizer: 日本化学会第92春季年会
  • Place of Presentation: 慶應義塾大学（横浜市）
  • Year and Date: 平成24年3月27日
• [Presentation] STRUCTURE AND FUNCTION OF BACTERIORHODOPSIN RECONSTITUTED INTO PARTIALLY FLUORINATED PHOSPHATIDYLCHOLINE LIPOSOME
  • Author(s): Yoshino, M, Kikukawa, T., Takagi, T., Yokoyama, Y., Takahashi, H., Baba, T., Kanamori, T., Demura, M., Sonoyama, M.
  • Organizer: 「揺らぎと生体機能」第５回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東大寺総合文化センター（奈良市）
  • Year and Date: 平成24年1月7日
• [Presentation] The fast proton release of proteorhodopsin at low pH
  • Author(s): 田母神淳，菊川峰志，下野和実，奈良敏文，宗行英朗，加茂直樹
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学（姫路市）
  • Year and Date: 平成23年9月7日
• [Presentation] Volume change during the Cl- transport of Natronomonas pharaonis halorhodopsin
  • Author(s): 柴崎宏介，菊川峰志，神谷昌克，相沢智康，河野敬一，加茂直樹，出村誠
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学（姫路市）
  • Year and Date: 平成23年9月16日
• [Presentation] Role of Ser171 for the stabilization of NpHR trimer
  • Author(s): 塚本卓，寺田浩太，中川摩里恵，田巻初，神谷昌克，菊川峰志，相沢智康，河野敬一，出村 誠
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学（姫路市）
  • Year and Date: 平成23年9月16日
• [Presentation] Reconstitution of bacteriorhodopsin into partially fluorinated phosphatidylcholine liposomes
  • Author(s): 吉野賢，菊川峰志，横山泰範，高木俊之，高橋浩，出村誠，馬場照彦，金森敏幸，園山正史
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学（姫路市）
  • Year and Date: 平成23年9月16日
• [Presentation] Decay kinetics of the M photointermediate of bacteriorhodopsin in short chain phosphatidylcholine micelles
  • Author(s): 桑原由美子，福元美奈，菊川峰志，出村誠，園山正史
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学（姫路市）
  • Year and Date: 平成23年9月16日
• [Presentation] キサントロドプシンの光誘起プロトン移動の解析
  • Author(s): 菊川峰志，佐藤由美，田母神淳，下野和実，神谷昌克，相沢智康，河野敬一，出村誠，加茂直樹
  • Organizer: 第11回蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク（大阪府）
  • Year and Date: 平成23年6月9日
• [Presentation] 非線形サンプリングを用いた膜タンパク質の固体NMR測定
  • Author(s): 田巻初，江川文子，松木陽，神谷昌克，菊川峰志，相沢智康，河野敬一，藤原敏道，出村誠
  • Organizer: 第11回蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク（大阪府
  • Year and Date: 平成23年6月8日
• [Book] Photo-induced Proton Transfers of Microbial Rhodopsins, In Molecular Photochemistry - Various Aspects (Dr. Satyen Saha, Ed.) (2012)
  • Author(s): Kikukawa, T., Tamogami, J., Shimono, K., Demura, M., Nara, T., Kamo, N.
  • Total Pages: 89-108
  • Publisher: InTech