光駆動型イオンポンプ：ハロロドプシンのクロライド輸送素過程の解明

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23510251
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 菊川 峰志 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 講師 (20281842)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮内 正二 東邦大学, 薬学部, 教授 (30202352)
• Keywords: ハロロドプシン / イオンポンプ / レチナール / フォトサイクル

Research Abstract

高度好塩菌の細胞膜に存在するハロロドプシン(HR)は、光によって駆動されるCl-ポンプ蛋白質である。内包する色素レチナールの光異性化をきっかけとして、複数の中間体を経由する光反応サイクルをまわり、この間に、1個のCl-を細胞の外側から内側へ輸送する。本研究では、中間体間の遷移時に起こるCl-輸送素過程の解析と、そこに係わる重要アミノ酸残基の同定を通して、HRの分子機構を考察してきた。成果の概要は以下の通りである。３番が最終年度に得た成果である。
１． 高度好塩菌 H. salinarum由来のHRの大腸菌発現系を用いた調製法の確立：HRの研究には、主にH. salinarumとN.pharaonis由来のHRが用いられてきたが、前者のHR（HsHR）を容易に調製する方法がなかった。大腸菌細胞膜にHsHRを発現させ、膜可溶化時にレチナールを加えることによって、活性型のHsHRを容易に調製できることを明らかとした。
２． 光反応サイクル後期中間体の遷移に同期したCl－輸送素過程の解明： HRと複合体を形成しているカロテノイドの吸収スペクトル変化を利用して、HRのCl－輸送素過程を解析した。その結果、O中間体生成と崩壊時に、Cl－の細胞質側への放出と細胞外側からの取り込みが起こること、さらに、後続のNpHR’中間体の崩壊時には、Cl－の初期の結合サイトへの移動が起こることが示唆された。
３． Cl－放出時におこる過渡的な解離定数上昇の生理的意義の解明：HRは光励起に伴う構造変化によって、Cl－への解離定数を過渡的に上昇させて細胞質側への放出を行う。解離定数の上昇が限定的となる種々の変異体を用いた解析により、解離定数の上昇は、細胞膜電位が存在する生理的環境においても、Cl－輸送活性を高く維持するために必要であることが明らかとなった。

Research Products

• [Journal Article] Role of Thr218 in the Light-Driven Anion Pump Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis (2013)
  • Author(s): Shibasaki, K., Shigemura, H., Kikukawa, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Kawano, K., Kamo, N., Demura, M
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 52 Pages: 9257-9268
  • DOI: 10.1021/bi401295e
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Physicochemical Studies of Bacteriorhodopsin Reconstituted in Partially Fluorinated Phosphatidylcholine Bilayers (2013)
  • Author(s): Yoshino, M., Kikukawa, T., Takahashi, H., Takagi, T., Yokoyama, Y., Amii, H., Baba, T., Kanamori, T., Sonoyama, M.
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 117 Pages: 5422-5429
  • DOI: 10.1021/jp311665z
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 二量体化した Di-O-Tetradecylphosphatidylcholine への膜タンパ ク質バクテリオロドプシンの再構成 (2014)
  • Author(s): 土田直之、高木俊之、菊川峰志、高橋 浩、金森敏幸、園山正史
  • Organizer: 日本化学会第94春季年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学（名古屋市）
  • Year and Date: 20140327-20140330
• [Presentation] Photochemical reaction in Acetabularia rhodopsin I (2013)
  • Author(s): Tamogami, J., Kikukawa, T., Shimono, K., Kimura-Someya, T., Shirouzu, M., Yokoyama, S., Kamo, N.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] Analysis of Cl- release and uptake steps of light-driven Cl- pump Natronomonas pharaonis halorhodopsin (2013)
  • Author(s): Kikukawa, T., Kusakabe, C., Kokubo, A., Tsukamoto, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Ihara, K., Kamo, N., Demura, M.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] Role of Thr218 in light-driven Cl- pump mechanism of Natronomonas pharaonis halorhodopsin (2013)
  • Author(s): Shibasaki, K., Shigemura, H., Kikukawa, T., Kamiya, M., Aizawa, T., Kamo, N., Demura, M.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] A Biophysical Study of Bacteriorhodopsin in Pseudocyclic Phosphatidylcholine Liposome (2013)
  • Author(s): Sonoyama, M., Yoshioka, S., Tsuchida, N., Takagi, T., Takahashi, H., Kikukawa, T., Kanamori, T.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] Low affinity of bacteriorhodopsin to partially fluorinated phosphatidylcholine in reconstituted membrane (2013)
  • Author(s): Yoshino, M., Kanayama, K., Kikukawa, T., Takagi, T., Takahashi, H., Yokoyama, Y., Amii, H., Kanamori, T., Somoyama, M.
  • Organizer: 第51回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都市）
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] リン脂質リポソームに再構成したバクテリオロドプシンの構造・機能に対するアシル鎖部分フッ素化の影響 (2013)
  • Author(s): 吉野賢、菊川峰志、高橋浩、高木俊之、横山泰範、網井秀樹、金森敏之、園山正史
  • Organizer: 第64回コロイドおよび界面化学討論会
  • Place of Presentation: 名古屋工業大学（名古屋市）
  • Year and Date: 20130918-20130920
• [Presentation] Native-like reconstitution of bacteriorhodopsin into novel partially fluorinated phosphatidylcholine lipid bilayer (2013)
  • Author(s): Sonoyama, M., Yoshino, M., Kikukawa, T., Takahashi, H., Takagi, T., Yokoyama, Y., Amii, H., Kanamori, T.
  • Organizer: The International Conference on Structural Genomics 2013
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（札幌市）
  • Year and Date: 20130729-20130801
• [Presentation] 部分フッ素化リン脂質・非フッ素化リン脂質二成分混合膜に再構成したバクテリオロドプシンの脂質選択性 (2013)
  • Author(s): 吉野 賢、菊川 峰志、高橋 浩、 高木 俊之、網井 秀樹、金森 敏幸、 園山 正史
  • Organizer: 第13回に本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
  • Year and Date: 20130612-20130614
• [Presentation] 光駆動型 Cl- ポンプハロロドプシンの光反応サイクルにおける荷電性残基の役割 (2013)
  • Author(s): 大塚 瞭、菊川 峰志、神谷 昌克、 相沢 智康、河野 敬一、加茂 直樹、 出村 誠
  • Organizer: 第13回に本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
  • Year and Date: 20130612-20130614
• [Presentation] ハロロドプシンの光反応サイクルに現れる膜電位依存性 (2013)
  • Author(s): 日下部 力、菊川 峰志、神谷 昌克、 相沢 智康、河野 敬一、井原 邦夫、 加茂 直樹、出村 誠
  • Organizer: 第13回に本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: とりぎん文化会館（鳥取市）
  • Year and Date: 20130612-20130614
• [Presentation] 部分フッ素化リン脂質を含む二成分系リン脂質混合膜における 膜タンパク質バクテリオロドプシンの分配挙動 (2013)
  • Author(s): 吉野賢、金山賢治、高橋浩、高木俊之、菊川峰志、横山泰範、網井秀樹、金森敏之、園山正史
  • Organizer: 第40回生体分子科学討論会
  • Place of Presentation: 大阪大学（吹田市）
  • Year and Date: 20130607-20130608