• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2011 Fiscal Year Research-status Report

プロテオミクス技術によるキナーゼ基質の簡便な同定システム

Research Project

Project/Area Number 23510261
Research InstitutionKitasato University

Principal Investigator

服部 成介  北里大学, 薬学部, 教授 (50143508)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 佐藤 龍洋  北里大学, 薬学部, 助教 (70547893)
Project Period (FY) 2011-04-28 – 2014-03-31
Keywordsキナーゼ / プロテオミクス / ERK / mTOR
Research Abstract

23年度は、1.in vitroリン酸化系によるキナーゼ基質の同定、2.in vivoリン酸化系によるキナーゼ基質の同定の二つの系を併用し、p38 MAPキナーゼ、ERKおよびmTORキナーゼをモデルキナーゼとして、キナーゼ基質の網羅的同定をおこなった。 in vitroリン酸化系によるキナーゼ基質の同定では、細胞抽出液をホスファターゼで脱リン酸化し、その後遺伝子組み換え法で作成したp38 MAPキナーゼを添加し、リン酸化反応を行なった。キナーゼ添加、無添加中のリン酸化タンパク質を精製し、2次元ゲル電気泳動で比較することにより、55の候補タンパク質を同定している。これまでに解析した7つの新規候補タンパク質のうち、6タンパク質が実際に細胞内でp38 MAPキナーゼ活性化にともないリン酸化されることを見いだし、このシステムが稼働していることを示している。 一方in vivoリン酸化系によるキナーゼ基質の同定は、mTORの特異的阻害剤であるラパマイシンおよびTorin1を用い、同様に2次元ゲル電気泳動でリン酸化タンパク質を比較することにより、多数の新規基質候補タンパク質を同定している。このうちの一つのタンパク質は、mTORによるリン酸化で細胞質-核間の移行が制御されることを見いだしている。また別の細胞骨格系制御因子は、mTORによるリン酸化でインテグリンとの結合が制御されることを見いだしている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

23年度では、1.in vitroリン酸化系によるキナーゼ基質の同定、2.in vivoリン酸化系によるキナーゼ基質の同定の二つのプロジェクトを遂行した。前者については、ホスファターゼによる脱リン酸化反応、組換えキナーゼによるin vitroリン酸化反応の最適化を行い、その結果55個の基質候補タンパク質を同定することができた。後者からも多数の新規基質候補が同定されている。このうち一部については、タグを賦与したタンパク質発現系を作成し、二次元ウェスタンブロッティングにより、リン酸化による等電点の酸性側シフトを観察しており、実際にキナーゼ活性化によるリン酸化を認めていることから、両プロジェクトともに順調に実施されていると考える。

Strategy for Future Research Activity

残りの研究期間においては、多数の基質候補タンパク質の中から興味深いものを選択し、リン酸化部位の同定、リン酸化部位の変異体の作成、リン酸化による機能制御とその細胞生物学的な意義を明らかにする必要がある。具体的には、リン酸化されるセリンあるいはスレオニン残基を、リン酸化されないアラニンに置換した変異体や、リン酸化状態を模倣するアスパラギン酸に置換した変異体を作成し、野生型タンパク質との比較を行い、リン酸化の意義を明らかにしていく。いくつかのタンパク質については、すでに研究を開始しているが、その数を増やして検討を進めていく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究経費は、すべて実験に使用する試薬、放射性同位体化合物、細胞培養用血清や器具であり、リン酸化部位の同定、リン酸化部位の変異体の作成、リン酸化による機能制御とその細胞生物学的な意義を明らかにするために使用する。

  • Research Products

    (11 results)

All 2011

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (6 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] VIP36 protein is a target of ectodomain shedding and regulates phagocytosis in macrophage Raw 264.7 cells.2011

    • Author(s)
      Shirakabe K, Hattori S, Seiki M, Koyasu S, Okada Y
    • Journal Title

      J Biol Chem

      Volume: 286 Pages: 43154-43163

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tyrosine phosphorylation-dependent activation of TRPC6 regulated by PLC-γ1 and nephrin: effect of mutations associated with focal segmental glomerulosclerosis.2011

    • Author(s)
      Mol Biol Cell.
    • Journal Title

      Kanda S, Harita Y, Shibagaki Y, Sekine T, Igarashi T, Inoue T, Hattori S.

      Volume: 22 Pages: 1824-1835

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of three new autoantibodies associated with systemic lupus erythematosus using two proteomic approaches.2011

    • Author(s)
      Katsumata Y, Kawaguchi Y, Baba S, Hattori S, Tahara K, Ito K, Iwasaki T, Yamaguchi N, Oyama M, Kozuka-Hata H, Hattori H, Nagata K, Yamanaka H, Hara M.
    • Journal Title

      Mol Cell Proteomics.

      Volume: 10 Pages: M110.005330

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Tyrosine kinase signaling in kidney glomerular podocytes.2011

    • Author(s)
      Kanda S, Harita Y, Hattori S.
    • Journal Title

      J Signal Transduct

      Volume: 05 Pages: 317852

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] VIP36 is a target of ectodomain shedding and regulates phagocytosis in macrophage.2011

    • Author(s)
      Shirakabe, K., Hattori, S., Seiki, M., Koyasu, S., Okada, Y.
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2011年12月16日
  • [Presentation] 低分子量Gタンパク質Rhebの新規シグナル伝達の解析2011

    • Author(s)
      赤須仁美、佐藤龍洋、柴垣芳夫、服部成介
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2011年12月16日
  • [Presentation] 持地保徳、柴垣芳夫、服部成介、太田安隆2011

    • Author(s)
      キネシンファミリータンパク質KIF11はFilGAP結合タンパク質である
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2011年12月16日
  • [Presentation] 飯田直幸、吉村憲彦、村越水香、武田彩香、高橋沙弥加、種五敦史、柴垣芳夫、服部成介2011

    • Author(s)
      Proteomic identification of novel ERK substrates using in vitro phosphorylation: ERK phosphorylates adducin and regulates its interaction with F-actin.
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2011年12月15日
  • [Presentation] Ishido, N., Nagai, H., Kobayashi, H., Sako, Y., Arai, T., Hattori, S., Matsuda, M., Fukuda, M., Nakamura, T.2011

    • Author(s)
      Analysis of Rab35 function in neurite outgrowth using FRET biosensors.
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2011年12月15日
  • [Presentation] 柴垣芳夫、生田尚子、井口幸子、水本清久、服部成介2011

    • Author(s)
      抗インフルエンザウイルス創薬のためのCapped RNAの合成法の開発.
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2011年12月13日
  • [Book] よくわかるゲノム医学2011

    • Author(s)
      服部成介、菅野-水島純子、菅野純夫
    • Total Pages
      203
    • Publisher
      羊土社

URL: 

Published: 2013-07-10  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi