2014 Fiscal Year Annual Research Report
抗硫酸化モノクローナル抗体作成による硫酸化プロテオーム解析
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23510265
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| Research Institution | Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences |
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Principal Investigator |
北川 幸己 新潟薬科大学, 薬学部, 教授 (60093853)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅田 真一 新潟薬科大学, 薬学部, 助教 (50424883)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2015-03-31
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| Keywords | 硫酸化タンパク質 / モノクローナル抗体 / ファージディスプレイ / プロテオーム解析 / チロシン硫酸化酵素 / 基質認識機構 / 固相ペプチド合成 / チオエステル縮合法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
硫酸化チロシン含有ペプチドの簡便な固相合成法をもとに、硫酸化タンパク質の検出・同定に用いる免疫化学的な研究用ツールを開発し、硫酸化プロテオーム解析に展開することが本課題の目的である。
① 硫酸化タンパク質に対するモノクローナル抗体の作成：チロシン硫酸エステルの化学的な不安定性によりマウス免疫法では硫酸化チロシンに特異的なモノクローナル抗体を取得できなかったことから、ファージディスプレイ法による抗体作成に変更した。抗原として数種の硫酸化ペプチドを合成し、それらを用いた基礎的な検討を行っている段階であり、抗硫酸化チロシン抗体の取得までに至っていない。
② チロシン硫酸化酵素の取得とチロシン硫酸化部位の配列モチーフの解析：大腸菌を用いたチロシン硫酸化酵素（TPST-1及び-2）の発現系を確立し、酵素活性をもつ2種のリコンビナントタンパクを取得した。ADYAE配列を基準としたアミノ酸欠損ペプチドや置換ペプチドを用いて、チロシン硫酸化に必要な最短基質ペプチドの鎖長及び配列モチーフを検索した。その結果、i) TPST-1及び-2の基質認識には、Y残基のN末端側に少なくとも2残基の鎖長が必要であり、-1位にはD残基が必要であること、ii) Y残基のC末端側+2位に酸性アミノ酸が存在すると硫酸化が進行しやすいこと等がわかり、チロシン硫酸化の基質ペプチドの配列モチーフとしてXDY（X:任意のアミノ酸）配列を見出した。
③ チオエステル縮合法による硫酸化ペプチドの合成研究：ペプチド鎖構築後にチオエステルに導く手法を用いて、1～3残基の硫酸化チロシンを含むペプチドチオエステルを調製した。縮合時にチオエステルセグメントに対して片方のペプチドセグメントを過剰量用いることで、縮合の際に見られたチオエステルの加水分解を顕著に抑制でき、収率よく複数個の硫酸化チロシンを含むペプチドを化学合成することに成功した。
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