2013 Fiscal Year Annual Research Report
光化学的新技術を用いたＤＮＡ結合タンパク質の網羅的クローニング法の開発
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23510286
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| Research Institution | Suzuka University of Medical Science |
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Principal Investigator |
定金 豊 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (60293304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大塚 功 九州保健福祉大学, 薬学部, 准教授 (20389589)
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| Keywords | 光反応 / プロテオーム / 分析化学 / バイオテクノロジー / 質量分析 / コンフォメーション病 |
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| Research Abstract |
DNAと結合するタンパク質は転写を始め，様々な生理的機能を調整する重要なタンパク質である．本研究では，DNAに結合するタンパク質を網羅的に解析する方法およびクローニングする方法の開発を目指した．そのために「化学」を土台に様々な方法との組合せを行った．光反応基ジアジリンをDNAに導入し結合タンパク質との共有結合を作る化学的な方法論を用いて，解析能力の向上とともにクローニング効率の向上を目指した「光化学的ゲルシフトアッセイ法」の確立に続き，「光化学的パニング法」と「質量分析法を利用した光化学的同定法」の開発に注力した．
「光化学的ゲルシフト法」は従来法で不可能であった複数のDNAタンパク質の結合を同時に解析できることを，光反応基を導入したoctamer配列DNAとリコンビナントPOUタンパク質と核抽出液とを用いて証明した．「光化学的パニング法」は前述のoctamer配列DNAとPOUタンパク質を発現するファージとの組合せで評価実験を行った．DNA配列に導入する光反応基の位置を様々に変化させるなどリガンド側構造の工夫を行った．さらに，結合複合体を形成させる条件を変えるなどの工夫も試みたが，予想よりも低い選択効率であった．大腸菌で発現したPOUタンパク質は結合活性をもつものの，ファージで提示させたタンパク質では結合活性が弱いことが考えられた．「質量分析法を利用した光化学的同定法」では，クロスリンクしたタンパク質を遊離させる方法の確立を目指した．質量分析を効率的に行うためには必須の技術であり，切断性の光反応基ユニットをDNAに結合させる方法について検討を行った．これらの技術を用いての解析対象として，神経疾患に注目し，プリオン病や脳血管性認知症についての基礎的な知見を得ることができた．
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