2013 Fiscal Year Annual Research Report
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23570008
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
鮎沢 大 横浜市立大学, その他の研究科, 教授 (00142109)
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| Keywords | 細胞老化 / ヌクレオソーム / ブロモデオキシウリジン |
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| Research Abstract |
出芽酵母系で用いた従来法では、細胞核を粗精製し、マイクロコッカルヌクレアーゼでリンカーDNAを部分的に切断する。DNAを精製し、制限酵素で切断し、RI標識したプローブを用いて通常のサザンブロット解析を行うことによって、容易にヌクレオソーム構造を解析できた。しかし、同様な方法により、ヒト細胞のPAI-1遺伝子について、ヌクレオソーム配置の変化を検出したが、多量のDNAが必要であり、検出されたバンドも薄く、感度が（酵母系では感度が4-50倍高い）不十分であると結論された。
本研究では、ヒト老化細胞においても、5-ブロモデオキシウリジンがヌクレオソーム構造を変化させるかどうか検証した。具体的には、ヒト細胞の初期老化応答遺伝PAI-1遺伝子近傍のヌクレオソーム配置を鋭敏に検出するために、広範囲のヌクレオソーム配置を解析できる「プライマーPCR法」と精密なヌクレオソーム位置を解析できる「プライマー伸長法」を構築した。とくに、「プライマー伸長法」を重視し、その開発と応用に時間を割いた。
マイクロコッカルヌクレアーゼで切断したDNAをプライマー伸長で選択的に合成し、とリンカーDNAを結合させてPCRを行うと、再現性に乏しいバンドが多数出現した。これらの非特異的なバンドをいかにして最小に抑えるかに大半の労力を費やした。最終年度には、いくつかのDNA修飾酵素を用いて、特異的なバンドを増幅することにほぼ成功した。検出感度は大幅に改善され、ヒトゲノム上のヌクレオソーム配置（5-7個）を正確に決定できる段階まで達した。研究は不完全であったが、完成を目指しさらに継続する予定である。
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