2012 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム安定性維持機構に関連する遺伝子の分離と機能解析
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23570012
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| Research Institution | National Institute of Radiological Sciences |
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Principal Investigator |
菅谷 公彦 独立行政法人放射線医学総合研究所, その他部局等, 研究員 (80280741)
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| Keywords | 遺伝学 / 遺伝子 / ゲノム / ゲノム安定性維持機構 / 温度感受性変異株 |
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| Research Abstract |
本研究課題は、哺乳類培養細胞の温度感受性変異株を用いて、染色体安定性維持機構に関連する遺伝子を分離し、その機能を明らかにすることを目的とする。研究対象である温度感受性変異株は、制限温度(39℃)において染色体不安定性やDNA合成活性の低下などの表現型を示す。本研究では、解析が進んでいない変異株に関して原因遺伝子の分離と機能の解明を行う。また、対象とする温度感受性変異株には、DNA合成活性の低下やS期での細胞周期の異常などの表現型を示すものも少なくない。そこで、変異株中の複製反応を評価できる実験系を確立し、複製反応と染色体不安定性との関連を明らかにする。平成24年度は、以下の項目に関して研究を行った。
１．温度感受性変異株の原因遺伝子の探索と機能解析
ハムスターCHO-K1細胞由来の温度感受性変異株を研究対象として、断片化したヒトゲノムDNAの導入による相補実験を終了した。最終的に３株の変異株から制限温度下で生育可能となった形質変換株が得られた。分離した形質変換細胞よりゲノムDNAを調製し、ヒト特異的なAlu配列を利用したPCRと塩基配列の解析を行ったが、相補に寄与した遺伝子の特定に至っていない。なおtsTM3株に関しては、原因遺伝子として同定したユビキチン活性化酵素について、野生型遺伝子の導入による相補実験やウェスタンブロッティングによる機能の解析を行い、その成果を学会にて発表した。
２．DNA複製反応の解析系の確立
核酸前駆体アナログを用いたDNA複製反応の解析を行い、伸長反応を評価する実験系としてCldUとIdUによる標識からDNAファイバーを解析する方法を構築した。また、DNA合成活性の低下の表現型を示すtsTM18株に関して、DNA複製を解析する候補とした２ヶ所の遺伝子座について、これまでのスプライシングの異常に関する成果と合わせて原著論文として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は東日本大震災の影響や福島第一原発の事故に関する業務などで、ヒトDNAによる温度感受性の相補と形質変換株の分離が遅れていたが、本年度内に対象とした10株の候補変異株の全てに関して相補実験を終了した。最終的に３株の変異株から制限温度下で生育可能となった形質変換株が得られ、ヒト特異的なAlu配列を利用したPCRによる原因遺伝子の探索と塩基配列の解析を行っているが、相補に寄与した遺伝子の特定に至っていない。一方、tsTM3株に関しては原因遺伝子であるユビキチン活性化酵素に関して、野生型遺伝子の導入による相補実験やウェスタンブロッティングにより、ユビキチン活性化酵素の核内における機能の解明など計画以上に進展している。また、DNA複製反応の解析系の確立に関しては、各種の核酸前駆体アナログを用いたDNA複製反応の評価を行い、伸長反応を評価する実験系としてCldUとIdUにより新生DNA鎖を標識しDNAファイバーを作製して解析する方法を構築できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究対象である温度感受性変異株のうち、染色体不安定性の表現型を示す変異株の多くは、制限温度下の自然復帰頻度(自然発症の生存コロニーの出現頻度)が高く、相補実験操作によりその頻度が上昇する傾向にあった。これらの変異株は、相補実験による原因遺伝子の同定に不向きの細胞群と考えられ、個別に対策を検討する必要がある。そこで、これらの原因遺伝子の探索に関しては、科研費の新学術領域「ゲノム支援」への応募など、より効率的な方法を模索し随時計画を見直しながら進めたい。
また、予想以上の成果が得られているtsTM3株に関しては、原因遺伝子であるユビキチン活性化酵素について、変異の同定と機能解析について原著論文として研究をまとめるように進めたい。
温度感受性変異株中の複製反応の解析に関しては、CldUとIdUを用いて新生DNA鎖を標識しDNAファイバーを作製して、DNA鎖伸長反応を解析する方法を構築できたので、染色体安定性維持機構と複製反応との連関を解析したい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
温度感受性変異株の原因遺伝子の分離に関しては、制限温度下で生育可能となった形質変換株を対象として、ヒト特異的なAlu配列を利用したPCRと塩基配列の解析による原因遺伝子の探索を進めるとともに、サザンハイブリダイゼーションによるヒトゲノム断片の探索も試してみたい。予想以上の成果が得られているtsTM3株に関しては、細胞内のユビキチン化を評価するレポーターシステムを利用し、その核内の機能を詳細に解析する。
DNA複製反応の解析に関しては、非許容温度下で複製反応に異常を示すtsTM3株などの変異株を対象に、CldUとIdUによる標識とDNAファイバーの解析により伸長反応を評価し、染色体安定性維持機構と複製反応との連関を解析したい。
これらの計画を進めるに当たり、消耗品費として分子生物学的な解析に用いる試薬とキット類、そして細胞生物学的な解析に用いる試薬の購入費を計上した。また、研究成果発表のための学会参加費と旅費を計上した。
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