2011 Fiscal Year Research-status Report
高等植物細胞壁のアラビノガラクタン－プロテインの糖鎖構造と機能
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23570048
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
円谷 陽一 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10142233)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | 植物細胞壁 / 細胞壁多糖 / アラビノガラクタン-プロテイン / ガラクタナーゼ / エノキタケ |
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| Research Abstract |
植物の細胞壁は主にセルロースと各種の多糖（ペクチン、ヘミセルロース）ならびにアラビノガラクタン-プロテイン（AGP）と呼ばれる糖タンパク質で構成される。本研究ではAGPの糖鎖に着目し、糖鎖を特異的に分解する酵素の探索、酵素遺伝子のクローニング、酵素によるAGP糖鎖の断片化と構造解析、得られたオリゴ糖の生理機能解析を目指す。 申請者達は、微生物起源の酵素を検索・精製して、AGP糖鎖の特異的分解酵素（特定の糖鎖配列を認識して分解する酵素）を見出した。このうち、エキソ-β-1,3-ガラクタナーゼとエンド-β-1,6-ガラクタナーゼは新規な酵素であり、EC numberが付与されている。本申請課題では、さらなるAGPの糖鎖分解酵素の検索と精製を目指す。具体的には、エンド-β-1,3-ガラクタナーゼとエキソ-β-1,6-ガラクタナーゼに着目する。これら酵素を用いた糖鎖の断片化と構造解明を進める。得られたオリゴ糖の生理機能解明を試みる。これらの実験ステップによってAGPの糖鎖構造・機能相関に関する知見の進展を図る。 平成23年度はエンド-β-1,3-ガラクタナーゼの探索を行い、エノキタケ培養液に酵素活性を見出した。培養液からイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーにより酵素を精製した。精製酵素の相対分子量は30 kDa だった。精製酵素のＮ末アミノ酸配列を調べ、その配列をもとにエノキタケcDNAデーターベースを利用して全長cDNAを単離した。cDNAを発現ベクターに組込み、ピキア酵母を用いて組換え酵素を作製した。様々な多糖類を用いて酵素の基質特異性を調べたところ、ネイティブ酵素、組換え酵素いずれもβ-1,3-ガラクタンに最も活性を示した。これらの成果を専門誌（Journal of Biological Chemistry, 286巻, 2011年）に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成23年度の研究実施計画では、エノキタケ培養液からのエンド-β-1,3-ガラクタナーゼの精製を予定していたが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等で酵素を精製することができた。実施計画では平成24年度に目的酵素をコードしている遺伝子をクローニングする計画であったが、平成23年度内にクローニングが終了し、またピキア酵母を用いて組換え酵素タンパク質を発現・調製できた。Native酵素と組換え酵素の一部の性質を明らかにすることができた。これらの研究成果は論文として発表した。研究実施計画より早く研究を進めることができ、満足のいく研究達成度であると自己評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実施計画より研究を早く進めることが出来たが、平成23年度と、平成24年度予定の一部のみが達成済みで、他の予定項目について研究を進める。実施計画に従って、本研究で得られたエンド-β-1,3-ガラクタナーゼならびに当研究室で調製した各種酵素を用いてAGP糖鎖の断片化（オリゴ糖化）する。得られたオリゴ糖の構造解析を化学的・酵素的手法ならびに機器分析によって解析する。さらに、研究最終年度の平成25年度には得られたオリゴ糖の生理機能を明らかにできるように、平成24年度では生理活性測定方法の検討を進める。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
交付申請の年度別・費目別内訳に基づいて研究費を使用する。物品費では、50万円以上の物品購入の予定はなく、実験遂行に必要な機材、試薬、等の購入に充てる。旅費は国内学科参加費、申請書に記載した専門技法を有する研究協力者との協議費用、等を予定している。
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[Journal Article] Endo-β-1,3-galactanase from winter mushroom Flammulina velutipes2011
Author(s)
Toshihisa Kotake, Naohiro Hirata, Yuta Degi, Maki Ishiguro, Kiminari Kitazawa, Ryohei Takata, Hitomi Ichinose, Satoshi Kaneko, Kiyohiko Igarashi, Masahiro Samejima, and Yoichi Tsumuraya
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Journal Title
Journal of Biological Chemistry
Volume: 286
Pages: 27848-27854
Peer Reviewed
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[Presentation] Endo-β-1,3-galactanase from winter mushroom Flammulina velutipes and its action on arabinogalactan-protein2011
Author(s)
Toshihisa Kotake, Naohiro Hirata, Yuta Degi, Maki Ishiguro, Kiminari Kitazawa, Ryohei Takata, Hitomi Ichinose, Satoshi Kaneko, Kiyohiko Igarashi, Masahiro Samejima, and Yoichi Tsumuraya
Organizer
The 4th Conference on Plant Wall Biosynthesis
Place of Presentation
淡路夢舞台国際会議場（兵庫県）
Year and Date
2011年10月3日
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