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2012 Fiscal Year Research-status Report

炎症微小環境ニッチとしてのヒアルロン酸ーSHAP複合体の形成機構の研究

Research Project

Project/Area Number 23570148
Research InstitutionAichi Medical University

Principal Investigator

木全 弘治  愛知医科大学, その他部局等, 名誉教授 (10022641)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 卓 麗聖  愛知医科大学, 医学部, 准教授 (00399031)
Keywords炎症 / 酵素 / 細胞接着 / ヒアルロン酸 / 血清蛋白質
Research Abstract

(1)酵素因子の精製:質量分析で得られた8個の候補蛋白質分子について、そのcDNAを細胞発現させて酵素活性の有無を調べ、陽性を示した一個の候補をさらに組換えて蛋白質発現させたが、活性は検出されず、組換え発現蛋白質の性質が不安定で、分解された可能性が強くなった。そこで、TSG6強制発現により酵素因子活性の発現増強させたHLF細胞の培養上清から特異抗体アフィニティーカラムによりTSG6を除き、そのまま酵素の精製に供したが、やはり精製途中で活性を失った。牛血清中に存在する活性は安定であることから、HLF細胞培養上清の酵素源が原因であると考えた。偶然にグリオーマ細胞C6についてDMEM培地だけでも2週間程培養でき、培養上清中に高い酵素因子活性が存在することを見出した。この活性因子は、従来と同様にヘパリンカラムやITIアフィニティーカラムで精製できることが判明したので、現在、急遽、C6培養上清を大量調製し、酵素因子の均一化を目指して精製を試みている。均一化が出来れば、部分アミノ酸配列の情報を得て、当初のproteomix解析で得た8個の候補蛋白質の配列のどれかに一致するものがないかを調べて遺伝子配列を知る。
(2)two-hybrid法を用いた酵素因子の解析:
前年度に使用した候補蛋白質の発現系では、安定発現ができないことが判明したので、本年度は、まず発現システムの改善を試みた。大腸菌発現ベクターpFLAG-ATS及びBL21(DE3)株大腸菌を用いると、蛋白質の発現量自体は高くないが、高割合で可溶性蛋白質として回収されることを見出したので、この発現系を用いて、two-hybrid法で得られた候補因子の融合蛋白質を発現、アフィニティーカラム精製し、マウスITIとの結合活性を調べた。ELISA法では、弱い相互作用が認められたが、ゲルろ過法や免疫沈降法では明確の陽性結果をえられなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

蛋白質発現系に問題がある。おそらく強い分解系の働きにより、候補分子の組換蛋白質の調製がうまく行かず、その改善に時間をかけたため、予定より研究の進行が遅れている。酵素蛋白質と思われる遺伝子発現蛋白質の精製による方法とtwo-hybrid法のいずれの方法に現段階では、候補分子であるとの強力な証拠を得られていない。

Strategy for Future Research Activity

発現ベクター及び発現システムを変えて、蛋白質の安定発現を再度、試みる。酵素活性の検出及び候補因子であるなどの確かな証拠が得られたならば、予定の蛋白質の性質の検討やノックアウトマウス作成を急ぐ。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

前年度に、活性の検出に至ってないが、大腸菌において融合蛋白質の発現に成功したので、それらの抗体の作成を行う。抗体の特性を確認した上で、炎症反応におけるこれら分子の動態を解析する。また、その生物活性について明確な答えを得るために、哺乳動物細胞や昆虫細胞の発現系を用いて融合蛋白質の作製し、生物活性の解析を行う。生物活性が認められた場合、その生物活性の分子機序を追究する。また遺伝子配列情報から、ノックアウトマウスの作成の準備をする。さらに、製薬に向けて、酵素活性を抑制または増強するような化合物の探索を検討する。

  • Research Products

    (29 results)

All 2013 2012

All Journal Article (22 results) (of which Peer Reviewed: 21 results) Presentation (5 results) (of which Invited: 2 results) Book (2 results)

  • [Journal Article] Crucial role of hyaluronan in neointimal formation after vascular injury.2013

    • Author(s)
      Kashima Y, Takahashi M, Shiba Y, Itano N, Izawa A, Koyama J, Nakayama J, Taniguchi S, Kimata K, Ikeda U.
    • Journal Title

      PLoS One

      Volume: 8 Pages: e58760

    • DOI

      doi: 10.1371/journal.pone.0058760.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Suppression of hyaluronan synthesis alleviates inflammatory response in murine arthritis and in human rheumatoid synovial fibroblasts.2013

    • Author(s)
      Yoshioka Y, Kozawa E, Urakawa H, Arai E, Futamura N, Zhuo L, Kimata K, Ishiguro N, Nishida Y.
    • Journal Title

      Arthritis Rheum.

      Volume: 65 Pages: 1160-1170

    • DOI

      doi: 10.1002/art.37861.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Application of chondroitin sulfate derivatives for understanding axonal guidance in the nervous system during development2013

    • Author(s)
      Ichijo H, Sugiura N, Kimata K
    • Journal Title

      Polymers

      Volume: 5 Pages: 254-268

    • DOI

      10.3390/polym50x000x

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Nephronectin binds to heparan sulfate proteoglycans via its MAM domain.2013

    • Author(s)
      Sato Y, Shimono C, Li S, Nakano I, Norioka N, Sugiura N, Kimata K, Yamada M, Sekiguchi K.
    • Journal Title

      Matrix Biol.

      Volume: 32 Pages: 188-195

    • DOI

      10.1016/j.matbio.2013.01.005.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase Isoform-dependent Regulatory Effects of Heparin on the Activities of Various Proteases in Mast Cells and the Biosynthesis of 6-O-Sulfated Heparin.2013

    • Author(s)
      Anower-E-Khuda MF, Habuchi H, Nagai N, Habuchi O, Yokochi T, Kimata K.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 288 Pages: 3705-3717

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.416651.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Moderate repulsive effects of E-unit-containing chondroitin sulfate (CSE) on behavior of retinal growth cones.2013

    • Author(s)
      Shimbo M, Ando S, Sugiura N, Kimata K, Ichijo H. Brain Res. 2013 Jan 23;1491:34-43.
    • Journal Title

      Brain Res.

      Volume: 1491 Pages: 34-43

    • DOI

      10.1016/j.brainres.2012.11.011.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Inhibitory effect of chondroitin sulfate type e on the binding step of human T-cell leukemia virus type 1.2013

    • Author(s)
      Jinno-Oue A, Tanaka A, Shimizu N, Mori T, Sugiura N, Kimata K, Isomura H, Hoshino H.
    • Journal Title

      AIDS Res Hum Retroviruses.

      Volume: 29 Pages: 621-629

    • DOI

      10.1089/AID.2012.0156.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Role of hyaluronan synthase 1 in the changes of hyaluronan content and size distribution after intracerebral hemorrhage in mice.2013

    • Author(s)
      Ding H, Jiang J, Y Tang, Dong Y, Dong Q, Ren H, Zhuo L, Kimata K.
    • Journal Title

      Chin J Clin Neurosci

      Volume: 21 Pages: 138-145

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 血清蛋白その他の生化学検査:ヒアルロン酸2013

    • Author(s)
      卓麗聖、木全弘治
    • Journal Title

      内科

      Volume: 111 Pages: in press

  • [Journal Article] Single-molecular enzymatic elongation of hyaluronan polymers visualized by high-speed atomic force microscopy.2012

    • Author(s)
      Mori T, Hirose A, Hagiwara T, Ohtsuka M, Kakuta Y, Kimata K, Okahata Y.
    • Journal Title

      J Am Chem Soc.

      Volume: 134 Pages: 20254-20257

    • DOI

      10.1021/ja309646s.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Construction of a chondroitin sulfate library with defined structures and analysis of molecular interactions.2012

    • Author(s)
      Sugiura N, Shioiri T, Chiba M, Sato T, Narimatsu H, Kimata K, Watanabe H.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 287 Pages: 43390-43400

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.412676.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Chondroitin sulfate synthase-2 is necessary for chain extension of chondroitin sulfate but not critical for skeletal development.2012

    • Author(s)
      Ogawa H, Hatano S, Sugiura N, Nagai N, Sato T, Shimizu K, Kimata K, Narimatsu H, Watanabe H.
    • Journal Title

      PLoS One.

      Volume: 7 Pages: e43806

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0043806.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The structural basis for a coordinated reaction catalyzed by a bifunctional glycosyltransferase in chondroitin biosynthesis.2012

    • Author(s)
      Sobhany M, Kakuta Y, Sugiura N, Kimata K, Negishi M.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 287 Pages: 36022-36028

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.375873.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Versican/PG-M is essential for ventricular septal formation subsequent to cardiac atrioventricular cushion development.2012

    • Author(s)
      Hatano S, Kimata K, Hiraiwa N, Kusakabe M, Isogai Z, Adachi E, Shinomura T, Watanabe H.
    • Journal Title

      Glycobiology

      Volume: 22 Pages: 1268-1277

    • DOI

      10.1093/glycob/cws095.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Effects of dexamethasone on tissue injury and reconstruction in ethanol/steroid injection therapy for allergic rhinitis2012

    • Author(s)
      Kimura M, Sugaya N, Kimata K, Kawachi M, Sawada M, Kuroda H, Takei M, Inafuku S and Wu M-D
    • Journal Title

      J Aller Ther

      Volume: S5 Pages: 2155-6121

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Hyaluronan expressed by the hematopoietic microenvironment is required for bone marrow hematopoiesis.2012

    • Author(s)
      Goncharova V, Serobyan N, Iizuka S, Schraufstatter I, de Ridder A, Povaliy T, Wacker V, Itano N, Kimata K, Orlovskaja IA, Yamaguchi Y, Khaldoyanidi S.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 287 Pages: 25419-25433

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.376699.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Kinetics of iterative carbohydrate transfer to polysaccharide catalyzed by chondroitin polymerase on a highly sensitive flow-type 27 MHz quartz-crystal microbalance.2012

    • Author(s)
      Mori T, Kodera T, Yoshimine H, Kakuta Y, Sugiura N, Kimata K, Okahata Y.
    • Journal Title

      Chemistry

      Volume: 18 Pages: 7388-7393

    • DOI

      10.1002/chem.201200342.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Heparan sulfate subdomains that are degraded by Sulf accumulate in cerebral amyloid ß plaques of Alzheimer's disease: evidence from mouse models and patients.2012

    • Author(s)
      Hosono-Fukao T, Ohtake-Niimi S, Hoshino H, Britschgi M, Akatsu H, Hossain MM, Nishitsuji K, van Kuppevelt TH, Kimata K, Michikawa M, Wyss-Coray T, Uchimura K.
    • Journal Title

      Am J Pathol.

      Volume: 180 Pages: 2056-2067

    • DOI

      10.1016/j.ajpath.2012.01.015.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Restriction of mast cell proliferation through hyaluronan synthesis by co-cultured fibroblasts.2012

    • Author(s)
      Takano H, Furuta K, Yamashita K, Sakanaka M, Itano N, Gohda E, Nakayama K, Kimata K, Sugimoto Y, Ichikawa A, Tanaka S.
    • Journal Title

      Biol Pharm Bull.

      Volume: 35 Pages: 408-412

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystallization and X-ray diffraction analysis of chondroitin lyase from baculovirus: envelope protein ODV-E66.2012

    • Author(s)
      Kawaguchi Y, Sugiura N, Onishi M, Kimata K, Kimura M, Kakuta Y.
    • Journal Title

      Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.

      Volume: 68 Pages: 190-192

    • DOI

      10.1107/S1744309111053164.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Enhanced inflammation and accelerated wound closure following tetraphorbol ester application or full-thickness wounding in mice lacking hyaluronan synthases Has1 and Has3.2012

    • Author(s)
      Mack JA, Feldman RJ, Itano N, Kimata K, Lauer M, Hascall VC, Maytin EV.
    • Journal Title

      J Invest Dermatol.

      Volume: 132 Pages: 198-207

    • DOI

      10.1038/jid.2011.248.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Inhibition of hyaluronan synthesis in breast cancer cells by 4-methylumbelliferone suppresses tumorigenicity in vitro and metastatic lesions of bone in vivo.2012

    • Author(s)
      Urakawa H, Nishida Y, Wasa J, Arai E, Zhuo L, Kimata K, Kozawa E, Futamura N, Ishiguro N.
    • Journal Title

      Int J Cancer.

      Volume: 130 Pages: 454-466

    • DOI

      10.1038/bjc.2011.459.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] SHAPヒアルロン酸複合体は顕微鏡的多発血管炎における疾患活動性評価のsurrogate markerとなり得るか.2013

    • Author(s)
      河合浩寿、森田博之、北川渡、三浦直人、坂野章吾、菊地正悟、卓麗聖、木全弘治、今井裕一
    • Organizer
      第56回日本腎臓学会学術総会
    • Place of Presentation
      東京国際フォーラム
    • Year and Date
      20130510-20130512
  • [Presentation] Heparan sulfate 6-O-sulfation – What we have learnt from the knockout mice2013

    • Author(s)
      Kimata K
    • Organizer
      The 20th PG forum
    • Place of Presentation
      Tokyo Medical and Dental University
    • Year and Date
      20130309-20130309
    • Invited
  • [Presentation] ヒアルロン酸に共有結合する血清蛋白質、SHAPの機能と疾患との関連2013

    • Author(s)
      卓麗聖
    • Organizer
      神奈川科学技術アカデミー教育講座「糖鎖科学・糖鎖工学の基礎から応用」
    • Place of Presentation
      かながわサイエンスパーク、川崎市
    • Year and Date
      20130121-20130122
    • Invited
  • [Presentation] Abnormal Heparan sulfate content in HME patient blood and the possible diagnostic application.2012

    • Author(s)
      Anower-E-Khuda MF, Habuchi H, Morita M, Yokochi T, Matsumoto K, Kimata K.
    • Organizer
      The 85th annual meeting of the Japanese Biochemical Society
    • Place of Presentation
      Marine Messe Fukuoka, Fukuoka, Japan
    • Year and Date
      20121214-20121216
  • [Presentation] Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase isoform-dependent regulatory effects of heparin on the activities of various proteases in mast cells and the biosynthesis of 6-O-sulfated heparin.2012

    • Author(s)
      Anower-E-Khuda MF, Habuchi H, Nagai N, Yokochi T, Habuchi O, Sugaya N, Kimata K.
    • Organizer
      Proteoglycans Gordon Research Conference
    • Place of Presentation
      Proctor Academy, Andover, NH, USA
    • Year and Date
      20120608-20120613
  • [Book] Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes: Hyaluronan synthase 1-3 (HAS1-3)2013

    • Author(s)
      Itano N, Kimata K
    • Total Pages
      9
    • Publisher
      Springer
  • [Book] Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes: Heparan-sulfate 6-O-sulfotransferase 1-3 (HS6ST1-3)2013

    • Author(s)
      Nagai N, Kimata K
    • Total Pages
      12
    • Publisher
      Springer

URL: 

Published: 2014-07-24  

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