2011 Fiscal Year Research-status Report
多機能性プロテオグリカン分子創出のための糖鎖工学基盤技術の開発
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23570157
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
柿崎 育子 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80302024)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | プロテオグリカン |
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| Research Abstract |
グリコシダーゼを用いたプロテオグリカンの糖鎖（グリコサミノグリカン）の組み換え技術の開発を目的としている。本年度は以下の研究を行った。１．グリコシダーゼの反応基質としての各種グリコサミノグリカンの調製：ヒアルロン酸及び各種コンドロイチン硫酸のオリゴ糖を調製し、還元末端を蛍光標識（ピリジルアミノ化（PA化））した。また、プロテオグリカンの糖鎖とコアぺプチドとの橋渡しの糖鎖構造をもつオリゴ糖（蛍光標識）を培養細胞で作らせた。これらを、ドナー基質由来の糖鎖を伸ばすための糖転移反応のアクセプター基質として用いる。種々の構造のドナーを準備するため、コンドロイチン硫酸及びヘパリンの脱硫酸化物を化学処理により調製した。２．プロテオグリカンの糖鎖に作用するグリコシダーゼの基質特異性の解析：今年度は、セルラーゼとヒアルロニダーゼの反応について調べた。精巣性ヒアルロニダーゼの基質特異性を検討した結果、ヒアルロン酸、各種コンドロイチン硫酸の他、これまでこの酵素が作用しないと考えられていた糖鎖の低分子化も観察された。このことは、これらの糖鎖をヒアルロニダーゼの糖転移反応のドナーとして利用できる可能性を示す重要な結果である。ある種のセルラーゼは、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸のいずれの糖鎖をもつプロテオグリカンに対しても作用し、コアペプチドとの橋渡しの糖鎖構造をもつグリコサミノグリカンを無傷で切り出す。このセルラーゼの加水分解の至適条件を明らかにした。一方、上記１で調製した橋渡しの糖鎖構造をもつコンドロイチン硫酸オリゴ糖（蛍光標識）、または人工ペプチド（蛍光標識）をアクセプターとし、ペプチドコンドロイチン硫酸をドナーに用いて糖転移の反応条件（pH, 温度, 時間, 反応生成物の検出のためのHPLCの原理と条件）を検討したが、ドナーのコンドロイチン硫酸からの糖鎖の転移は観察されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の具体的な目的・計画に、「プロテオグリカンの糖鎖に作用するグリコシダーゼの基質特異性の解析」をあげていた。本年度はグリコシダーゼの中でも、申請者らの過去の糖鎖工学研究で独自の方法で利用してきたエンド型グリコシダーゼ（精巣性ヒアルロニダーゼとある種のセルラーゼ）についての未解決の点を調べた。ヒアルロニダーゼについては、今後の糖鎖工学的展開に重要な可能性が見出されたが、セルラーゼについては期待する結果が得られなかった。また、本年度は、単糖を端から１つはずすエキソ型グリコシダーゼの基質特異性は検討できなかった。従って、全体としての達成度はやや遅れている。研究の遅れは、震災後の物流の状況に加え、各種のグリコシダーゼを扱っていて、長年の蓄積された信頼度の高いデータを有する企業さんが23年度半ばに試薬部門を終了したことも影響している。本研究の最終目的（様々な酵素を系統立てて利用することによるプロテオグリカンの糖鎖組み換え法の開発）を達成するためには、今後も容易に入手可能な酵素を用いなければならない。従って、試薬部門終了前の本年度限り入手できる酵素での検討は見合わせた。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請書作成時の24年度の主な計画は、23年度に引き続いての「(1)プロテオグリカンの糖鎖に作用するグリコシダーゼの基質特異性の解析」と、その結果をもとにした応用の「(2)目的の糖鎖構造構築のためのグリコシダーゼを組み合わせる反応の設計」である。(1)は(2)の基礎データとして必要不可欠であるので、24年度は、23年度に検討できなかった種類のグリコシダーゼについての検討も行う。具体的には、下記のような計画で進める。１．23年度の課題のうち、検討できなかった項目の検討（エキソ型グリコシダーゼの基質特異性の検討）を行う。特に、本研究の目的を達成できるか否かは、エキソ型グリコシダーゼの新たな利用法を見出すことに係っている。２．また、ヒアルロニダーゼの糖鎖組み換えへの新しい利用法を念頭に、これまでには試されていない種々の基質の組み合わせを検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
特に「プロテオグリカンの糖鎖に作用するグリコシダーゼの基質特異性の解析」に係る消耗品（研究試薬等）に研究費を充てる。繰越し分の研究費は、その中で、「エキソ型グリコシダーゼの基質特異性の検討」のための実験に充てる。１．糖鎖関連酵素、各種グリコサミノグリカンの購入に充てる。これらの従来の入手先である試薬部門の終了に伴い、新しい入手先を検索して購入するため、目的の反応の検討に先立ち、従来購入していた酵素と同等品かどうかのチェックの反応から行わなければならない。２．酵素反応生成物の分析用HPLCカラムが必要である。分析方法の検討も行わなければならないため、各種原理のHPLCカラムが必要である。硫酸化オリゴ糖の糖鎖長毎の分析に必須の順相系HPLCのカラムは劣化が激しいため、同じカラムを複数本購入する必要がある。３．酵素反応の基質として、市販品にはない構造のグリコサミノグリカンも使用する。それらの調製は、研究補助員に支援していただく。研究補助に係る費用を申請した。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Anti-inflammatory effect of proteoglycan and progesterone on human uterine cervical fibroblasts.2012
Author(s)
Fukuyama, A., Tanaka, K., Kakizaki, I., Kasai, K., Chiba, M., Nakamura, T., and Mizunuma, H.
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Journal Title
Life Sci.
Volume: 90
Pages: 484-488
DOI
Peer Reviewed
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