2011 Fiscal Year Research-status Report
複製停止を感知する複合体による停止フォーク安定化機構の解明
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23570183
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
田中 卓 (財)東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主席研究員 (80425686)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 修復・組換え / 複製フォーク / フォーク安定化因子 / 分子間相互作用 |
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| Research Abstract |
細胞内で停止したDNA複製フォークは、フォーク安定化因子により保護されることが知られている。真核細胞では、分裂酵母のMrc1とSwi1-Swi3複合体が、フォーク安定化因子として知られ、我々は、実際にこれら因子が生化学的に合成停止フォーク構造を特異的に認識することを報告した。複製回復機構の全体像を解明するために、これらの因子と複製複合体を構成するタンパク質群との相互作用の検出を試みた。まず、フォーク安定化因子と、複製フォーク進行において重要な働きをするMCMヘリカーゼ、および、MCMの活性化因子としての役割を持つCdc45との相互作用を検出するため、フォーク安定化因子に対する特異的抗体を用いたin vitro免疫沈降法により、これらのタンパク質の検出を試みた。その結果、Cdc45が弱いながらMrc1-Swi複合体と相互作用する可能性を示唆する結果を得た。その他の因子とは明確な相互作用が検出されず、今後の条件検討を要する。一方、大腸菌におけるフォーク安定化因子と予想されているPriAタンパク質が、in vivoで停止フォークに結合していることを示すため、染色体免疫沈降法（ChIP）とマイクロアレイ（chip）による解析（ChIP-on-chip）と、免疫染色によるPriAの検出を重ねて試みた結果、チミン枯渇処理をした細胞においては、前者において特異的なピークのクラスターが、後者においては核様体内に特異的スポットが検出され、枯渇から解放すると、これが拡散することを確認した。以上の結果は、真核細胞における複製回復機構に関わる複合体の機能解析に寄与する可能性を示し、さらに大腸菌PriAタンパク質が、染色体脆弱部位を検出したり、停止後の再開始反応で複製装置がどう振る舞うかを解析するための有用なツールとして利用できる可能性を強く示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
進行中の複製フォークが様々な原因で停止することは知られているものの、実際の生きた細胞内における、停止フォークの安定化と複製再開始の分子機構は詳細に明らかにされていない。これを解明するためには、フォーク安定化因子と複製複合体との相互作用とその振る舞いの解明、および、停止フォークを検出する技術の確立を達成する必要がある。大腸菌においても、PriAタンパク質が停止フォークを認識することは試験管内で以前から示されてきたが、細胞内で直接示した報告はない。今回、真核細胞のフォーク安定化因子と複製装置構成因子との物理的相互作用を検出し、また、PriAタンパク質が生細胞内の停止フォークに結合している可能性を示唆したことは、実際の細胞内でのフォーク停止およびその回復に関わる因子の振る舞いを同定する可能性を示すものであり、本分子機構の確立に向けた大きな前進と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
複製複合体構成因子の精製および検出方法の条件検討を要する。これらの因子の精製方法は、本研究室で既にある程度確立されているので、この情報を参考に精製を進める。また、in vitro免疫沈降法については、DNA、ATP等の関連する要素の必要性等を検討し、特異的相互作用を検出できる条件を探る。加えて、新たな相互作用因子を同定し、機能解析するために、フォーク安定化因子の特異的抗体を使用した免疫沈降法により、細胞抽出液からの結合タンパク質の分離同定を試みる。さらに、大腸菌においては実際に特異的な領域で複製フォークが停止するような変異体、あるいは、PriAの機能を限定する変異体で、PriAのゲノム上での特異的結合を確認し、また、その他のフォーク構成因子を同定して、大腸菌における停止フォーク検出技術を確立する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
分子間相互作用の検討において、標識化DNAを使用するため、放射性同位体標識核酸試薬を積算した。SPR法を使用する場合においては、センサーチップが必要となるのでこれを購入する。また、タンパク質精製のためのカラム類は、新規購入する必要があるものがあるのでこれを計上した。さらに、フォーク停止を起こしやすい領域の網羅的検出は、マイクロアレイによるしか方法がないので、このchip購入費用を計上する。国内旅費は国内の学会にて研究報告をするための費用として、妥当な額を計上した。
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Research Products
(1 results)
