2013 Fiscal Year Annual Research Report
アンチセンスプローブを用いた生きた細胞のｍＲＮＡイメージング
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23570207
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岡部 弘基 東京大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20455398)
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| Keywords | mRNA / イメージング / アンチセンスプローブ / 生細胞 |
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| Research Abstract |
本研究では、線形アンチセンスプローブを用いた生細胞内mRNAイメージング法を確立して、細胞質におけるmRNAを介したダイナミックな翻訳活性調節や分解といった細胞機能に重要な現象の解析を行うことを目指している。
まず、生細胞内における線形アンチセンスプローブの細胞内におけるハイブリダイゼーションの特性を分析し、mRNAとの結合、解離の反応速度定数（konやkoff）や解離定数（Kd）を算出した。さらに、その特性を活かして、細胞がストレスを受けた際に直接内在性mRNAを蛍光イメージングすることにより、速やかにストレス顆粒（SG）へ局在化する過程の観察に成功した。また、任意のmRNAを標的としたプローブ開発を目指し、GAPDH mRNAを標的とした候補プローブを設計した。プローブ結合を定量的に評価するため、プローブが内在性mRNAとの結合により見かけ分子量が著しく増大して拡散が遅くなることに着目して、アンチセンスプローブの状態を高感度蛍光顕微鏡を用いた細胞内拡散の定量的解析法により詳細に解析した。このうち10種類以上のプローブが内在性mRNAと結合している結果を得た。
さらに、mRNAとの親和性の高いプローブを用いて、COS7細胞の内在性GAPDH mRNAのイメージング、および蛍光相関分光法（FCS）を用いた発現量の定量的解析を行った。最後に、本法をsiRNAにより選択的mRNA分解を誘導した際のmRNA発現量の実時間追跡へと応用し、RNA分解の実時間解析に成功した。
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