2011 Fiscal Year Research-status Report
Ｎ・Ｃ末端でリンクした環状抗菌ペプチドの生合成機構と環化意義の解明
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23580101
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
川井 泰 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (00261496)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 忠夫 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00118358)
西村 順子 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 技術専門職員 (10241556)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | バクテリオシン / 抗菌ペプチド / 環状構造 / 乳酸菌 / ガセリ菌 |
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| Research Abstract |
１ 環状化に関わる遺伝子（群）の特定： 環状バクテリオシン・ガセリシンA（全58アミノ酸残基）の生合成遺伝子（gaaBCADITE）を組込んだ発現プラスミドpGAA2を鋳型として、PCRにより各遺伝子または複数遺伝子を欠損させ、L.gasseri基準株に導入した結果、gaaC以外の全ての遺伝子がガセリシンAの生合成に関与していることを明らかにした。次いで、gaaC欠損株の培養上清から、HPLCを用いて本ガセリシンAを精製し、N末端配列分析と質量分析を行ったところ、D22の一カ所で切断された非環状ガセリシンAが得られた。本結果から、GaaCが環化後のガセリシンAを自身または他の推定プロティナーゼから保護している可能性が示唆された。２ 環化形成タンパク質（酵素）の基質特異性試験： pGAA2を用いてガセリシンAのリーダー切断サイト近傍とN・C末端近傍のアミノ酸残基を適宜変更して発現させたところ、N-1およびI1残基の自由度が比較的高い一方で、環状化形成にはA58残基が重要であることを明らかにした。また、Y2、W3の側鎖である芳香族アミノ酸が生産と活性維持に重要であり、（推定）環化酵素反応ポケットに関与していることが考えられた。さらにリーダーペプチドのN末端からMetを除く14アミノ酸残基の欠損により、培養上精にガセリシンAの活性が消失したことから、ガセリシンAはこれまで報告されている他のリーダー配列が短い環状バクテリオシンとは異なり、リーダー配列は環状化ではなく生産性に重要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目標としていた生合成遺伝子の特定をはじめ、ガセリシンA抗体の作成と検出、環化形成過程におけるリーダー配列の役割推定、および環化形成タンパク質（酵素）のアミノ酸残基選択性を明らかにすることが出来た。また、リーダーペプチドの短縮（欠損）試験では、世界で初めてリーダー配列の役割の一端を解明することができた。 しかしながら、リーダーペプチド中の重要なアミノ酸残基・領域の特定には至らず、次年度の課題に組み込むこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
１ 環化形成酵素における触媒アミノ酸残基の特定： ガセリシンAの推定環化形成酵素は、GaaBCかGaaDI、もしくは両者複合型と考えられる。そこで、pGAA2を鋳型としてPCRにより、セリンまたはシステインプロティナーゼと推定される環化形成酵素（特にGaaB）の推定触媒アミノ酸残基（Asp・Glu、His、Ser、およびCys）を適宜変更して、L.gasseri基準株に導入後、環化形成能の消失から活性中心のアミノ酸残基を明らかにし、環化形成酵素を同定する。２ リーダーペプチドおよびガセリシンＡ付着認識タンパク質の同定： gaaBCDITEを単体または複数で無細胞系発現システムにより発現・精製した後、各種化学合成リーダーペプチドまたは精製環状ガセリシンAとの分子間相互作用解析を行う。また、前年度で生産が確認されたリーダーペプチドからさらにアミノ酸を欠損させ最小配列を確定した後、GaaTEなどの上記発現株を用いて、環状ガセリシンAの取得を試みる。本結果から環化形成酵素による1段階環化または多段階酵素反応（別酵素でリーダー切断後に環化形成酵素により環化）が確定し、ガセリシンA環状化生成機構の解明を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
次年度は、引き続きアミノ酸改変試験・遺伝子配列解析を行うと共に、高価かつ未経験である無細胞系発現システムに取り組むことから、ペプチド合成費用を含めて消耗品費を昨年よりも多めに計上した。また、学会発表とセミナーを少なくとも４件（全て国内）を予定しており、学生を含めた旅費も計上した。さらに、成果として原著論文の投稿を2編予定している。
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[Journal Article] Food preservative potential of gassericin A-containing concentrate prepared from cheese whey culture supernatant of Lactobacillus gasseri LA392012
Author(s)
K. NAKAMURA, K. ARAKAWA, Y. KAWAI, N. YASUTA,T. CHUJO, M. WATANABE, H. IIOKA, M. TANIOKA, J. NISHIMURA, H. KITAZAWA, K. TSURUMI and T. SAITO
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Journal Title
Animal Science Journal
Volume: accepted
Pages: in press
Peer Reviewed
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