炭酸固定反応を触媒する脱炭酸酵素の機能発現解析とその応用

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23580108
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 吉田 豊和 岐阜大学, 工学部, 准教授 (90220657)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: 酵素変換 / 脱炭酸酵素 / 炭酸固定

Research Abstract

ピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素は効率的に炭酸固定反応をも触媒する酵素であるが、これまでに大腸菌などで機能発現しなかった。一方、4-ヒドロキシ安息香酸脱炭酸酵素を用いた実験から、少なくとも活性発現には３つのサブユニットが必要であることが分かってきた。そこで、未同定のタンパク質サブユニットが活性発現に不可欠であると考え、２種の微生物からピロール2-カルボン酸脱炭酸酵素を精製し、活性発現に関与するタンパク質因子の探索を進めた。イオン交換樹脂を使用した精製ステップにおいて顕著に比活性が低下し、弱く会合したサブユニットが解離することが予想された。微弱に残存する活性を指標とし、脱炭酸酵素を部分精製し、機能発現に関与する候補タンパク質の同定を進めた。電気泳動像の解析から候補タンパク質を推定した段階である。　炭酸固定反応を触媒する新たな脱炭酸酵素を見いだすために、2,4-ジヒドロキシ安息香の酸脱炭酸酵素を探索することとした。好気条件で集積培養を行なったところ、ベンゼン環の開裂反応が優先的に進行し、脱炭酸反応を触媒する微生物を集積することは困難であった。そこで、微好気条件（静置培養）で集積培養を行なった結果、脱炭酸反応で生じるレゾルシノールを生成する培養ロットが認められた。微生物を未分離の状態で休止菌体を調整し、目的酵素反応を持つ微生物が潜在することを確証した。また、基質特異性を予備的に調べた結果、幅広い基質の脱炭酸反応を触媒することが明らかと成った。今後、活性菌の単離と酵素精製と特徴解析を進めることを計画している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

炭酸固定反応を触媒する脱炭酸酵素の機能発現に必要と考えられる複数のタンパク質因子を見いだすために、２種類のピロール-2-カルボン酸脱炭酸酵素の精製を進め、予想した候補タンパク質を見いだすことができた。この結果にもとづき、次年度の実験計画が予定通りに実施できる状況にある。　新規の可逆的脱炭酸酵素の探索については、数多くの試料を対象としたスクリーニングを実施した結果、新しい酵素反応を持つ微生物が自然界に存在することを確証した。この成果を踏まえて、次年度以降に活性を持つ微生物株の単離、酵素特性解明が進展すると考えられ、目的とする研究の展開が達成できている。

Strategy for Future Research Activity

酵素の機能発現に寄与するタンパク質サブユニットの構造情報を取得し、遺伝子クローニングと発現、既知酵素遺伝子産物との相互作用の解析を進める。このことによって、効率的な炭酸固定反応プロセスの構築の基盤を築くことができる。一方、新規脱炭酸酵素については、活性株の純粋分離と活性向上を図り、反応特性を基礎的に解析する。また、精製酵素を調製し、酵素遺伝子クローニングに必要なタンパク質情報を取得する。　本年度の予算に対して残額が生じたのは、もう一つの研究予定であった熱安定性を示す脱炭酸酵素の探索を予定通りに遂行できなかったためである。これは2,4-ジヒドロキシ安息香酸の脱炭酸酵素の探索と並行して実施することを計画したが、2,4-ジヒドロキシ安息香酸を用いた集積培養から微生物が数多く得られ、その評価に時間を要したためである。熱安定性脱炭酸酵素の分離のための集積培養は実施しているため、その分離と活性評価を次年度に行なうこととする。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

酵素タンパク質一次構造解析の分析費用が多額を要する予定である。また、さらに未同定のタンパク質因子を決定するために、多量の精製酵素標品を調整する必要があり、クロマトグラフィー担体とカラムの購入が必要となる。その後には、遺伝子組換え実験の汎用試薬とシーケンシング用試薬にコンスタントに経費を要する。大型の機器の購入は計画していないが、コンスタントに消耗性試薬・器具類が必要である。前年度の残額は、引き続き探索を続ける脱炭酸酵素の活性評価を実施するための、液体クロマトグラフィー用溶媒の購入や分析用試薬の購入に充当する。