食用担子菌による効率的なラッカーゼ等の有用タンパク質発現系の確立

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23580454
• Research Institution: Kitami Institute of Technology
• Principal Investigator: 佐藤 利次 北見工業大学, 工学部, 准教授 (00390881)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2015-03-31
• Keywords: ラッカーゼ / 食用担子菌 / シイタケ / 遺伝子発現系 / 漆

Research Abstract

本研究では、担子菌類の中でも安全性が高く有用性が高い食用担子菌類の効率的な遺伝子導入法を確立することと、ラッカーゼなどの有用遺伝子発現ベクター系を確立することを目的とする。本年度は、シイタケに関する遺伝子導入法と発現ベクターの構築,及び漆ラッカーゼの単離について検討した。　遺伝子導入法に関しては、エレクロトロポレーターによる裁断菌糸への直接導入法の予備実験として、電流量やパルス回数による裁断菌糸の死滅に及ぼす影響について検討した。現在、1×10の7乗程度の生細胞の懸濁液の調製が可能となり、細胞の生残率が10％程度になる条件を検討中である。　発現ベクターの構築に関しては、シイタケ用ベクターとして構成的発現遺伝子（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）プロモータと光誘導性遺伝子（チロシナーゼ遺伝子）プロモータを利用したベクターに、シイタケlcc1遺伝子を挿入した pChG-lcc1 と pChT-lcc1 をそれぞれ構築した。構築したベクターは、従来法であるプロトプラストを用いたポリエチレングリコール（PEG）-塩化カルシウム 法によって、シイタケに導入した。　また、次年度予定していた漆からのラッカーゼ遺伝子の単離のために、漆の葉からのcDNA調製とゲノムDNAの調製を行った。また、予備試験として、登録されている漆ラッカーゼ遺伝子情報をもとに、数種類のプライマーを合成し、PCRによる増幅を試みた。しかしながら、現在のところ増幅バンドは確認できていない。原因としては、登録情報のもとになった漆と、今回単離に用いた漆との種の違いによる配列の相違や、今回原料とした漆の葉では、時期的な問題から、ラッカーゼが発現していなかった可能性などが考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

遺伝子導入法については、当初予定より若干遅れ気味であるが、シイタケのベクター構築に関しては、組換え体が確認できたことから、進展が認められた。ただし、ヒラタケ用のベクター構築を達成できなかったことから、ベクター構築全体としては若干の遅れが認められた。一方、単離には至らなかったものの、漆ラッカーゼの単離の検討に踏み込めたことは、当初予定より進展した。総合して考えると、おおむね順調に進展している、と考えられる。

Strategy for Future Research Activity

エレクトロポレーターによる遺伝子導入条件に関しては、裁断菌糸の10％生残率の条件を確定の上、既存ベクター等による遺伝子導入について引き続き検討する。また、得られた組換え体に関して解析を行う。さらに、漆ラッカーゼ遺伝子の単離については、保存性の高い領域をもとにした縮重プライマーをデザインして、それらを用いたPCRによる増幅を検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度の研究費は、消耗品としては、遺伝子単離及びベクター構築のためのDNA合成、遺伝子工学関連試薬、プラスチック器具類など、また、旅費として、調査旅費と学会参加旅費としての使用を計画している。