2011 Fiscal Year Research-status Report
宿主変異株を用いたＣ型肝炎ウイルスライフサイクルに関与する宿主因子の研究
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23590104
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
深澤 征義 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (20291130)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2016-03-31
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| Keywords | C型肝炎ウイルス |
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| Research Abstract |
RNAiライブラリを用いたHCV感染に耐性を有するHuh7.5.1由来細胞株の分離 本研究は、HCV感染に耐性を示す宿主変異株の分離を通じて、HCV感染・産生に必須な宿主因子をゲノムワイドに検索・同定し、依然として未知の点の多いHCVライフサイクルに関わる宿主分子メカニズムを分子細胞生物学的に明らかにすることを目的としている。そこで本年度は、shRNA lentivirusライブラリ（～55,000 transcripts, 3-5 shRNAs/gene）を導入した細胞ライブラリを用い、HCV感染に耐性を有するHuh7.5.1由来細胞株の分離を試みた。スクリーニング法には、強いHCV感染により宿主細胞傷害(細胞死）が引き起こされることを利用した。まず、本スクリーニング系が機能することを、HCV感染に必須である既知分子（CD81、Claudin1）のノックダウン細胞で確認した。スクリーニングに用いる細胞ライブラリの親細胞としてはCD81及びClaudin1を強制発現したHuh7.5.1由来細胞を用いた（既知因子が分離されるバックグラウンドを極力抑えるため）。細胞数は約10＾8個から行い、HCV感染を2回行った後、生き残る細胞を回収し、ゲノムDNAに挿入されたshRNA部分をPCRで増幅・クローニングし、その配列決定を行った。その結果、多数の挿入shRNA配列が同定された。そこで、各shRNAベクターを個々に作成し、各ノックダウン細胞を作成し、HCV感染実験を行った結果、少なくとも3つの細胞株でHCVに強い耐性を示すことがわかり、有効性が確認された。これらの細胞では、HCV感染も有意に低下していることも明らかとなった。今後詳細な解析を行っていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定で、本年度は、「RNAiライブラリを用いたHCV感染に耐性を有するHuh7.5.1由来細胞株の分離」を行うとしていたので、その目的は達成したと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度のスクリーニングにより、有用な細胞クローンが分離できたので、その性状解析を進め、HCVライフサイクルのどの段階に欠損があるのかについて、詳細に検討していく予定である。また、余裕があれば昨年度と同様のスクリーニングを再度行い、新しい細胞を分離することも考えている。最終的には、同定した因子の情報に基づき、新たな抗HCV薬タ-ゲットとなる宿主因子・過程を提示することを目指す。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
細胞スクリーニングやHCV感染培養系のための細胞培養用経費が40万円程度、HCV感染の検出・確認のための生化学的試薬に30万円程度・分子生物学的試薬に40万円程度を予定している。研究発表や研究情報収集・交換のための旅費に10万円程度、その他の文献代や実験補助の謝金に5万円程度を予定している。
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Research Products
(1 results)
