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2011 Fiscal Year Research-status Report

ストレスによる精神疾患発症における脳特異的転写因子NPAS4の役割

Research Project

Project/Area Number 23590299
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

日比 陽子  名古屋大学, 医学部附属病院, 特任助教 (70295616)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 山田 清文  名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30303639)
Project Period (FY) 2011-04-28 – 2014-03-31
KeywordsNPAS4 / stress / glucocorticoid / promoter
Research Abstract

本研究は、神経保護や神経分化に関連する機能を持つ転写因子Neuronal PAS domain 4 (NPAS4)がストレスにより発現抑制するメカニズムを解明することを目的としている。平成23年度は、NPAS4の発現をグルココルチコイド(GC)が抑制することを見いだし、さらにプロモーターアッセイを用いてNPAS4プロモーターにおけるグルココルチコイド受容体 (GR) の作用部位を調べた。3時間の拘束ストレス負荷時にGRアンタゴニストを腹腔投与したところ、NPAS4発現低下が抑制されたことからストレス下で増加するGCがNPAS4発現を抑制することが示唆された。次に、NPAS4のプロモーター領域をルシフェラーゼ cDNAの上流に組み込んだレポーターアッセイプラスミドを用いて、NPAS4プロモーター活性をGCが抑制するかどうかについて調べた。レポーターアッセイプラスミド導入後のNeuro2Aの培地にGRアンタゴニストを添加すると、濃度依存的にNPAS4プロモーター活性が上昇したことから、NPAS4プロモーター活性がGCにより抑制されることが明らかとなった。NPAS4プロモーターには、転写開始点から1~2kb上流の付近にGR が結合する配列であるグルココルチコイドレスポンスエレメント(GRE)が集中しており、この領域を段階的に欠失した変異プロモーターでは活性が著しく上昇した。さらに、クロマチンIPアッセイによってNPAS4プロモーターへのGRの結合も示されたことから、GCによる直接的なNPAS4プロモーター活性抑制が示唆された。以上の結果はストレスからNPAS4の発現抑制に至る機構の一端を明らかにするものであり、現在論文投稿中である。また、ストレス付加マウスの海馬でNPAS4プロモーターのメチル化が亢進していることを示唆するデータも得ている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成23年度の目標は(1)NPAS4プロモーター活性にグルココルチコイドが及ぼす影響についてレポーターアッセイを用いて解析し、さらに段階的欠失プロモーターを作成してNPAS4プロモーター活性抑制を行う部位を調べる。(2)NPAS4プロモーターのDNAメチル化について解析する。(3)NPAS4欠損マウスの行動解析を行う。であったが、これまでの研究によりグルココルチコイド受容体アンタゴニストがNPAS4プロモーター活性を上昇させることを示し、また段階的欠失プロモーターを用いたレポーターアッセイによりグルココルチコイドが直接的にNPAS4プロモーター活性抑制を行うことを示すなど、NPAS4の発現におけるグルココルチコイドの影響を明らかにできた。また、NPAS4遺伝子メチル化に関する解析でも、ストレス付加によるDNAメチル化上昇を示唆するデータを得ているので、ある程度の成果は得られている。NPAS4欠損マウスにおける行動解析は、現在進行中である。

Strategy for Future Research Activity

(1)レポーター発現解析:平成23年度に in vitroでグルココルチコイドがNPAS4の発現抑制を行うことを示したので、今後はさらにそのメカニズムを解明していく。NPAS4プロモーターの段階的欠失変異導入により確定した領域のGREに部位特異的変異導入を行い、レポーター発現解析によりグルココルチコイドがNPAS4プロモーター活性に影響を及ぼす部位をさらに詳細に解析する。またin vivoでのグルココルチコイドのNPAS4プロモーター抑制効果を検証するため、ストレス付加による生体内でのGRのNPAS4遺伝子への結合の変動について、マウス脳サンプルを用いてクロマチンIPアッセイを行い解析する。(2)エピジェネティクス解析:ストレス刺激が精神に及ぼす影響は長期間に渡り持続することが知られている。その持続にはDNAメチル化亢進の維持が要因としてあげられているため、ストレスによるNPAS4遺伝子メチル化上昇が、ストレス付加後どの程度の期間持続するのかについて解析する。また、副腎除去動物についてストレスを負荷し、NPAS4の発現変動を調べる。また、副腎除去がNPAS4プロモーター領域のヒストンアセチル化などの修飾レベルへおよぼす影響やDNAメチル化レベルへおよぼす影響を解析し、ストレスが内分泌系を介してエピジェネティック制御を変動させる可能性について追究する。さらに、ストレス負荷動物にDNA脱メチル化剤や精神疾患治療薬を投与し、NPAS4プロモーター領域のDNAメチル化レベルの確認を行うと共に、行動薬理学的解析で精神疾患様行動の発現について調べていく。(3)NPAS4欠損マウスのin vivo解析NPAS4遺伝子欠損動物の行動試験を継続して行うと共にNPAS4遺伝子欠損マウスの神経系の発達を抗体染色法やゴルジ染色法で解析する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

・NPAS4のプロモーター解析に用いるレポーターアッセイ用試薬や、部位特異的変異導入に用いるPCR試薬や各種制限酵素、DNA大量調整用のキット、細胞培養に必要なプレートと培地や血清を購入する。またクロマチンIPアッセイのためにキットや各種抗体を購入する。また、NPAS4プロモーター領域のDNAメチル化解析に用いるPyroMarkシステム用解析用試薬やプレート、オリゴヌクレオチドを購入する。生化学的解析に用いる各種抗体や各種インヒビターを購入する。・生体内におけるNPAS4プロモーターとグルココルチコイド受容体等各種制御因子の結合を調べるため、また行動試験を行うためのマウス購入と飼育費用に使用する。In vivoにおける免疫組織学的解析のため各種試薬を購入する。・旅費として、これまで得た結果について6月3~7日にスウェーデンで行われる国際神経薬理学会CINPで研究成果発表を行うため使用する。さらに、日本神経科学学会大会、日本神経精神薬理学会年会、日本分子生物学会年会、日本薬理学会年会、および日本薬学会年会における研究成果発表のために使用する。

  • Research Products

    (10 results)

All 2011 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (8 results)

  • [Journal Article] The hydrophobic dipeptide Leu-Ile inhibits immobility induced by repeated forced swimming via the induction of BDNF.2011

    • Author(s)
      Furukawa-Hibi, Y., Nitta, A., Ikeda, T., Morishita, K., Liu W, Ibi D., Alkam, T., Nabeshima, T., and Yamada, K.
    • Journal Title

      Behavioural Brain Research

      Volume: 220 Pages: 271-280

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Butyrylcholinesterase inhibitors ameliorate cognitive dysfunction induced by amyloid-β peptide in mice.2011

    • Author(s)
      Furukawa-Hibi, Y., Alkam T., Nitta, A., Matsuyama, A., Mizoguchi, H., Suzuki, K., Moussaoui, S., Yu, Q-S., Greig, N., Nagai, T. and Yamada, K.
    • Journal Title

      Behavioural Brain Research

      Volume: 225 Pages: 222-229

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] グルココルチコイドによる転写因子NPAS4の発現抑制機構 Glucocorticoid regulates the expression of neuronal PAS domain 4 (Npas4).

    • Author(s)
      日比 陽子、ユン ジェスク、永井 拓、山田 清文
    • Organizer
      第7回統合失調症学会
    • Place of Presentation
      名古屋 愛知県産業労働センター
    • Year and Date
      平成24年3月16日~17日
  • [Presentation] 神経発達関連転写因子NPAS4の発現調節機構の解明

    • Author(s)
      日比(古川)陽子、ユン ジェスク、永井 拓、 山田 清文
    • Organizer
      第34回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      国立京都国際会館・グランドプリンスホテル京都
    • Year and Date
      平成24年3月14日~16日
  • [Presentation] 神経発達関連転写因子NPAS4のストレスによる転写抑制機構の解明

    • Author(s)
      日比(古川)陽子、ユン ジェスク、永井 拓、 山田 清文
    • Organizer
      第119回日本薬理学会近畿部会
    • Place of Presentation
      名古屋 愛知県産業労働センター
    • Year and Date
      平成23年年7月8日
  • [Presentation] Stress reduces the expression of transcription factor, neuronal PAS domain 4 (NPAS4)

    • Author(s)
      Yoko Hibi, Jaesuk Yun, Taku Nagai and Kiyofumi Yamada
    • Organizer
      AsCNP
    • Place of Presentation
      韓国 ソウル
    • Year and Date
      平成23年9月23日~24日
  • [Presentation] The Role of Npas4 in Neurite Outgrowth and phosphorylation of Synapsin I

    • Author(s)
      Jaesuk Yun, Taku Nagai, Yoko Hibi, Keisuke Kuroda, Kozo Kaibuchi, Kiyofumi Yamada
    • Organizer
      AsCNP
    • Place of Presentation
      韓国 ソウル
    • Year and Date
      平成23年9月23日~24日
  • [Presentation] Transcriptional regulation of neuronal PAS domain 4 (NPAS4) by stress ストレスによるneuronal PAS domain 4 (NPAS4)の転写制御

    • Author(s)
      Yoko Hibi, Jaesuk Yun, Taku Nagai, Kiyofumi Yamada
    • Organizer
      Neuroscience 2011
    • Place of Presentation
      横浜  パシフィコ横浜
    • Year and Date
      平成23年9月14日~17日
  • [Presentation] Npas4 regulates neurite outgrowth and phosphoryation of synapsin I

    • Author(s)
      Jaesuk Yun, Taku Nagai, Yoko Hibi, Keisuke Kuroda, Kozo Kaibuchi, Kiyofumi Yamada
    • Organizer
      Neuroscience 2011
    • Place of Presentation
      横浜  パシフィコ横浜
    • Year and Date
      平成23年9月14日~17日
  • [Presentation] Methamphetamine-induced Npas4; possible role in neurite outgrowth and p-synapsin I expression

    • Author(s)
      Yun Jaesuk, Nagai Taku, Hibi Yoko, Kuroda Keisuke, Kaibuchi Kozo,Yamada Kiyofumi
    • Organizer
      平成23年度アルコール・薬物依存関連学会合同学術総会
    • Place of Presentation
      名古屋 愛知県産業労働センター
    • Year and Date
      平成23年10月13~15日

URL: 

Published: 2013-07-10  

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