体腔傷害における反応性中皮細胞の機能解析と病態診断および再生治療への応用

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23590436
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 本田 一穂 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (10256505)
• Keywords: 007 / 008 / 029

Research Abstract

平成24年度は、(1) 癌細胞に反応する中皮細胞の発現mRNAの網羅的解析、 (2)その分子のin vitroの系における発現確認、(3) 癌性腹膜炎モデルの作成を行った。
(1) 発現mRNAの網羅的解析：Transwellを用いて、ラット中皮細胞(RMC)とヒト大腸癌細胞株HCT116を非接触性に共培養し、RMCのmRNA発現をGeneChip法にて解析した。20515 geneのうち、発現がX2以上の増強：257 gene, x0.5未満の減弱：92 geneであった。X2以上に増強したもののうち、サイトカイン関連は11 gene (7種類)で、X4以上の増強は、MCP3とInhibinAであった。
(2) in vitroの系における発現確認： MCP3とInhibinAについて、in vitroの実験系における発現の実際を検討した。中皮細胞のCa結合蛋白であるCalretininについても検討を行った。 Transwellを用いた癌細胞との非接触共培養で、MCP3とInhibinAのmRNA発現は経時的(day0,1,3,7)に増強した。Western blot法では、InhibinAやCalretininのわずかな増加を認めたが、MCP3は検出できなかった（MCP3は今後培養上清をELISA法で検出する予定）。癌細胞と中皮細胞の混合培養（接触共培養）では、癌細胞との接触によって、MCP-3, InhibinAのmRNA発現や、InhibinAやCalretinin の蛋白発現が増加した。
(3) 癌性腹膜炎モデルの作成： Balb/cヌードマウスにHCT116細胞を5x10e6個/個体を腹腔内接種した。2-3週で癌性腹膜炎の状態が確認され、4週以降は血性腹水が増加した。組織学的に癌は腹膜播種より腸管や腹壁に浸潤していたが、血行性転移は見られなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度は、癌細胞に対する反応性中皮細胞の発現遺伝子を網羅的に解析し、発現が増強していたMCP-3とInhibinAの２つのサイトカインに焦点を絞り、in vitroの実験系で発現増強の検証を行った。この2つの因子と細胞内Ca結合蛋白であるCalretininが、癌に対する中皮細胞の反応性分子の一つであることが示唆された。今後、本研究の目的である「中皮細胞の多面的反応様式を利用した新たな診断・治療法の開発」を達成するためには、これらの分子の発現状況や病態との関連性を、in vivoの実験系でも検証していく必要がある。また、臨床的に応用するための手法を確立する必要がある。本研究の達成度がやや遅れている具体的理由として、
① In vitroの共培養系の細胞形態学的検討が遅れている。
② フローサイトメトリーを利用した解析手技の確立が遅れている。
③ 癌性腹膜炎動物モデルを用いた解析が遅れている。
であり、これらが次年度に取り組むべき課題と考えている。

Strategy for Future Research Activity

平成25年度は、これまで得られた知見をもとに、癌性腹膜炎を中心課題として、癌に反応する中皮細胞の特性を明らかにし、診断や治療への応用に役立つ基礎的知見を得ることを目標とする。今年度の具体的研究目標を以下の３点に集約する。
(1) In vitroの共培養系の機能・形態学的解析：癌細胞とラット中皮細胞の共培養下における中皮細胞の形態と機能の変化を検討する。タイムラプス顕微鏡を用いて、中皮細胞層への癌細胞の接着、浸潤とその際の中皮細胞の形態変化を観察する。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、細胞内骨格（アクチンなど）とカルレチニンやInhibinAなどのシグナル伝達因子の局在など明らかにする。電子顕微鏡では細胞内小器官の微細構造変化を検討する。
(2) フローサイトメトリー法による解析：In vitroの実験系で得られた中皮細胞の細胞表面マーカー（ポドプラニン、CD44など）や細胞内サイトカイン（MCP3やInhibinAなど）の発現をフローサイトメトリーで解析する。また、(3)のマウス癌性腹膜炎モデルで採取された腹水の中皮細胞にて同様の検討を行う。これらの検討で得られた知見から、癌性腹膜炎の腹水による診断や病態解明への応用を検討する。
(3) マウス癌性腹膜炎モデルの解析：Balb/cヌードマウスの腹腔内HCT116接種にて作成した癌性腹膜炎モデルにおいて、癌細胞と中皮細胞の反応様式を形態学的に解析する。癌性腹膜炎における癌細胞の接着、増殖、浸潤過程で中皮細胞がいかなる反応を示すかを、MCP-3, InhibinA, ポドプラニン、カルレチニン、CD44などの発現を中心に免疫組織学的に検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度の研究費は、細胞培養実験のための器具（チャンバースライドなど）、培地、血清、増殖因子、ELISAキット、PCR試薬、フローサイトメトリー関連試薬（抗体や標識蛍光など）、マウス癌性腹膜炎モデルの実験動物（ヌードマウス）の購入などに使用する。