2013 Fiscal Year Annual Research Report
蠕虫嫌気的ミトコンドリアキノールーフマル酸還元酵素の細菌発現系の開発
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23590484
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
坂元 君年 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (50361465)
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| Keywords | 蠕虫 / ミトコンドリア呼吸鎖 |
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| Research Abstract |
低酸素に適応した蠕虫ミトコンドリアに特有の嫌気的呼吸鎖の要であるキノール－フマル酸還元酵素（QFR）は好気的ミトコンドリア複合体IIの逆反応を効率よく触媒することで特徴付けられる。この反応を可能にする酵素学的特性を解明するに当たり、部位特異的変異体の特性解析から得られる情報は大きい。そこで、現在は確立されていない細菌での蠕虫QFRの発現系を構築し、活性評価、阻害剤応答、X線結晶構造解析を通じて反応機構の解明を目的とする。本研究計画については特にエキノコックスQFRについて機能的発現系の開発を目指している。
複合体IIの発現宿主候補の一つであるRhodospirillum rubrumについて、発現時に活性のみで機能的な発現が確認できるように、ゲノム遺伝子から複合体IIの遺伝子オペロン破壊株を作製した。Rhodobacter capsulatus同様に複合体IIは必須遺伝子であったため、単純な遺伝子破壊株は確立できず、破壊したオペロンをプラスミドによって相補する事でのみ得ることが出来た。また、発現するためのエキノコックスQFR遺伝子はR. rubrumで発現しやすいように人工遺伝子によりコドンを最適化させたものを得た。
これによって、エキノコックスQFR遺伝子のクローニング、発現宿主としてのR. rubrum, R. capsulatusの複合体II破壊株の作製が完了し、それぞれを宿主とした細菌複合体IIの異種発現にも成功した。R. rubrumとR. capsulatus複合体IIの双方のサブユニット半分ずつから構成されるキメラ酵素複合体も得たことから、エキノコックスQFRの発現には複合体の半分がR. rubrumのサブユニットからなるキメラ酵素複合体からその作成を開始し、発現用のプラスミドを得た。
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[Journal Article] Structure of the trypanosome cyanide-insensitive alternative oxidase2013
Author(s)
Shiba T, Kido Y, Sakamoto K, Inaoka DK, Tsuge C, Tatsumi R, Takahashi G, Balogun EO, Nara T, Aoki T, Honma T, Tanaka A, Inoue M, Matsuoka S, Saimoto H, Moore AL, Harada S, Kita K
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
Volume: 110
Pages: 4580-4585
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