2011 Fiscal Year Research-status Report
新興感染症起因細菌の感染宿主細胞内環境維持に関与する分子機構の解明
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23590514
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
大橋 典男 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (10169039)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉川 悠子 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (00580523)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | アナプラズマ症 / 新興感染症 / A. phagocytophilum / 宿主感染応答 / 細胞内寄生性細菌 |
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| Research Abstract |
新興感染症「アナプラズマ症」起因細菌のAnaplasma phagocytophilum (Ap)は、偏性細胞内寄生性細菌である。Apの感染過程は、初期、中期、後期の３段階に分けることができる。感染初期は宿主細胞への侵入とそれに続く増殖開始までの期間で、細胞内へ侵入したApは独自の寄生性小胞を形成し、リソソームとの融合を阻止し、宿主細胞のアポトーシスを遅延させて、Apの増殖時間を確保する。感染中期には宿主細胞質内に桑の実状のモルラと呼ばれるApに特徴的な増殖形態を形成し、感染後期では、モルラは宿主細胞質のほとんどを占めるまでに成熟し、今度は宿主細胞のアポトーシスを誘導して、細胞外へ脱出し新たな細胞へと感染を繰り返す。これまでの研究では感染初期に関するものが多く、本研究ではモルラ形成から細胞外脱出までの感染後期におけるApの分子感染維持機構について解明を進めている。これまでのプロテオミクス解析とパスウェイ解析から、Apの感染後期における宿主応答の細胞内シグナル伝達系には、Srcタンパク質が深く関与していることが示唆された。そこで、Ap感染におけるSrcの宿主細胞内変動について詳細な解析を行い、Ap感染に伴いSrc量が細胞内で増加することを見出した。さらに、Srcと相互作用するタンパク質候補として、ユビキチンリガーゼCblを見出し、Cblやその関連タンパク質、およびTubulinなどがAp感染で細胞内に蓄積することを明らかにした。一方で、我々はテトラサイクリン系抗生物質が感染後期の寄生性小胞内のApに対して静菌的ではなく、殺菌的に作用することを見出しており、その殺菌作用の分子メカニズムを解析している。そして、薬剤処理前後の感染細胞のマイクロアレイ解析から、宿主細胞のCTSG、DEPDC6、EGR1、ERP29、およびIER3の遺伝子発現量が感染後期で変動することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究に関しては、おおむね順調に進んでいる。Apは偏性寄生性細菌であるため、培養には常に宿主細胞が必要で、高度な組織培養技術が要求される。また、病原体の遺伝子改変技術の確立がほとんど不可能で、病原体側からのアプローチも困難である。したがって、感染分子機構を解明するためには、丁寧な感染実験を、時間をかけて繰り返すことにより、宿主側の感染関連分子の同定や感染に伴う細胞内シグナル伝達系を明らかにすることが望まれる。特に、感染中期から後期にかけての知見が乏しく、この点においては、本研究によりAp感染に伴った細胞内Src量の増加やSrcと相互作用するタンパク質候補のCblを見出したことは意義深い。さらに、Cblの関連タンパク質としてPI3Kp85のリン酸化促進やTubulinの細胞内蓄積も見出しており、Srcを中心としたシグナル伝達系を解明しつつある。 テトラサイクリン系抗生物質の殺菌効果の分子機構に関しては、マイクロアレイ解析から、CTSG（好中球アズール顆粒内セリンプロテアーゼ）の遺伝子発現が感染に伴い減少し、ドキシサイクリン (DC) 処理により上昇することを見出している。これは、DC処理によりApのタンパク合成が停止されると、宿主細胞はApを認識するようになり、CTSGなどを利用してApを殺菌する可能性が考えられた。また、DEPDC6（mTOR相互作用タンパク質）、ERP29（小胞体内局在シャペロンタンパク質）の遺伝子発現も感染に伴い減少し、DC処理により上昇、またはその減少が回復することを見出している。EGR1（細胞分化促進転写調節因子）は、感染により発現が上昇し、DC処理により減少する。さらにはIER3（Immediate early response 3）がAp感染により上昇し、DC処理によりさらに上昇することも明らかにしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Apの感染中期から後期にかけての細胞内環境維持機構について、これまでの研究成果に基づき、さらに関連する宿主側因子の絞り込みを進める。まず、宿主細胞側のシグナル伝達系に関しては、Ap感染に伴って蓄積されるSrcの細胞への影響を調べるため、SrcとCblの相互作用を介したPI3Kの下流シグナル伝達経路 (Aktなど)について、阻害剤（LY294002など）を用いて解析を行う。また、Ap感染によるSrc蓄積の原因についても、分解抑制、特にユビキチン・プロテアソーム阻害の可能性についても検討する。また、ドキシサイクリンによる殺菌作用を利用した宿主細胞応答の解析アプローチとして、同定した宿主側因子について、強制発現やRNAi発現抑制した培養細胞にApを感染させ、それらの挙動を分子生物学的に解析する。Apは感染初期には宿主細胞のアポトーシスを遅延させるが、感染後期にはAp細胞外放出のため強力なアポトーシスを誘導する。感染初期のアポトーシス遅延にはBfl-1の発現増加、また今回同定した宿主側因子のひとつであるEGR1の関与が示唆されている。感染後期でのEGR1の発現上昇はウエスタンブロット解析でも確認した。p53依存的アポトーシスを抑制することが知られているEGR1は感染後期においても、その発現が維持されていることから、感染後期に起こるアポトーシスはp53に依存している可能性が低い。また、FasおよびTNF-α依存的アポトーシスを抑制するIER3も感染後期で発現が維持されており、FasやTNF-α系の関与も考えにくい。DEPDC6は、ある種のミエローマ細胞で高発現しており、その発現減少はアポトーシスを誘導する。このように、Apの感染初期のアポトーシス遅延から感染後期の強力なアポトーシス誘導への移行は、異なるシグナル伝達系が複雑に絡みあっている可能性があり、その分子機構の解明に努める。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
研究費は、「物品費」が主である。具体的には、感染実験に必要な組織培養用の培地、血清、ピペット、培養フラスコなど、また免疫学的および生化学的解析に必須である宿主側因子の特異抗体、発現ベクター、siRNAなどで、必要に応じてマイクロアレイ試薬やプロテオミクス試薬を購入する。また、一般試薬・一般器具類、および遺伝子組換え用の特殊試薬の購入にも充てる。「旅費」は情報収集のために利用し、「謝金」は研究補助・資料整理のための人件費として使用する予定である。「その他」は、印刷製本または投稿料などの費用である。
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[Journal Article] Detection and characterization of p44/msp2 transcript variants of Anaplasma phagocytophilum from naturally infected ticks and wild deer in Japan2012
Author(s)
Gaowa, Wuritu, Wu, D., Yoshikawa, Y., Ohashi, N., Kawamori1, F., Sugiyama, K., Ohtake, M., Ohashi, M., Yamamoto, S., Kitano, T., Takada, N., Kawabata., H.
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Journal Title
Jpn. J. Infect. Dis.
Volume: 65
Pages: 79-83
Peer Reviewed
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[Journal Article] Molecular detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus ticks from Istanbul metropolitan area and rural Trakya (Thrace) region of Northwestern Turkey2011
Author(s)
Sen, E., Uchijima, Y., Kadosaka, T., Ohashi, N., Okamoto, Y., Fukui, T., Masuzawa, T.
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Journal Title
Ticks Tick Borne Dis.
Volume: 2
Pages: 94-98
Peer Reviewed
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[Journal Article] Detection of the new Ehrlichia species closely related to Ehrlichia ewingii from Haemaphysalis longicornis in Yonaguni Island, Okinawa, Japan2011
Author(s)
Matsumoto, K., Takeuchi, T., Yokoyama, N., Katagiri, Y., Ooshiro, M., Zakimi, S., Gaowa, Kawamori, F., Ohashi, N., Inokuma, H.
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Journal Title
J. Vet. Med. Sci.
Volume: 73
Pages: 1485-1488
Peer Reviewed
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[Presentation] Molecular epidemiological study of Rickettsiales bacteria in wild deer and mice in Shizuoka prefecture, Japan2011
Author(s)
Wuritu, Wu D., Yoshikawa Y., Furukawa E., Murakami T., Minato C., Kawamori F., Ohtake M., Ohashi M., Ohashi N.
Organizer
International Union of Microbiological Societies 2011 Congress
Place of Presentation
札幌
Year and Date
2011年9月9日
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