2012 Fiscal Year Research-status Report
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23590542
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
黒須 剛 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (70432432)
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| Keywords | デングウイルス / 新興・再興感染症 / マウスモデル / フラビウイルス |
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| Research Abstract |
本研究では、デングウイルス感染のマウスモデルを開発することを目標としている。これまで1型、２型及び４型デングウイルスprM-Eを含むデングウイルス/日本脳炎キメラマウスの作成に成功し、マウスでの感染性を確認した。
現在のところキメラウイルスは野生型マウスには致死性を示していないが、IFNレセプター(R) KOマウスに対して、致死性の感染を示した。標的は単球/マクロファージであり、樹状細胞も含まれ、ヒトでの感染における標的細胞と同様であることを確認する重要な知見と考えられる。興味深いことに骨髄で盛んにウイルスが増殖し、造血系の異常が起こっていることを確認している。デングウイルス感染患者では、強い骨髄抑制が起こるが、その原因は不明である。本実験の観察結果がこの機序解明のためのなんらかの手がかりになると考えられる。キメラウイルスは脾臓、胸腺、骨髄を中心に増殖し、末期には肺で盛んに増殖していた。脳でも死亡直前には増殖していたが、ウイルス量は他臓器を比較してかなり低かった。
デングウイルス感染は、１回目感染とは異なる型のウイルスに2回目以降に感染した場合に重症化すると考えられている。これは一回目感染により産生された抗デングウイルス抗体とウイルスとの免疫複合体が、Fcレセプターを介して単球/マクロファージに感染することでウイルス産生上昇し、重症化するためであると考えられている。この現象は抗体医薬やワクチン開発の鍵と考えられている。我々の系を用いて、抗デングウイルス抗体導入条件の違いにより、相反する２つの現象、致死性が高まる現象と防御する現象を観察している。デングウイルス感染者由来ヒト型モノクローナル抗体を用いて、治療効果の判定を始めた。総合的に考えて、ウイルス感染を追跡できる系が確立され、また抗体医薬品及びワクチン開発に有効な系であることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
キメラウイルスは野生型マウスには致死性はかなり低いが、野生型マウス由来の培養細胞では、日本脳炎ウイルスと同程度のウイルス産生を示した。さらにIFN-R KOマウスではキメラウイルスは高い増殖性・病原性を示した。このことから「マウス細胞で増殖するウイルスを作成する」という初めのステップをクリアーしたと考えられる。日本脳炎ウイルスは野生型マウスに致死性感染することから、日本脳炎ウイルスのprM-E領域が、野生型マウスで致死性を決める重要な因子であることが判明した。また、患者に由来する抗デングウイルスモノクローナル抗体を用いて防御効果の判定を行ったところ、中和試験と近い結果を得たが、より感受性の高い系（抗体間の防御効果の差が確認しやすい系）であることを確認した。マウス個体内でのウイルス増殖臓器、細胞が判明でき、抗デングウイルス抗体導入による感染防御効果と増悪効果の両方を観察できる系であることが確認され、治療法開発における系の有効性が示されたことは大きな進歩である。
感染により肝障害、感染によるフィブリノーゲン上昇、赤血球造成抑制が顕著に起こることを観察しており、病態解明の手掛かりを得ていると考えられる。開発された系で、今後in vtroとin vivoでの相違点、Type I及びII IFNの感染防御における役割、生体における経時的なウイルス増殖のダイナミックスが明らかになり、研究の展開が飛躍的に進むと考えられる。キメラウイルス及びデングウイルスのマウス個体内での標的細胞が、ヒトでのデングウイルスの標的細胞と同様に、単球/マクロファージ系及び樹状細胞であることが確認された。またそれぞれの臓器でのウイルス増殖も確認でき、感染初期には骨髄と脾臓でウイルスが良く産生されていることを確認した。今年度の目標であった標的細胞の同定を行えたことも考慮し、総合的に判断すると順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
デング出血熱の典型的症状は血漿漏出である。ヘマトクリット（Ht）値を測定することで血漿漏出を確認したところ、末期にHt値の上昇を観察した。しかし個体間での差があり、感染により確実に血漿漏出を起こしているかは確定されていない。今後、色素を用いて確認する。感染によるフィブリノーゲン上昇、赤血球造成抑制の原因を明らかにし、他の骨髄細胞の増殖抑制の有無を確認する。
感染後のウイルス産生を経時的に測定すると、時期によりウイルス増殖の中心になる場（臓器）が移動している。骨髄と脾臓が初期の増殖の場であり、後期には肺で盛んに増殖している。死の原因にはどの段階で、どの臓器でのウイルス増殖が最も影響しているか、異なるタイプのキメラウイルスを感染させ、致死性及び各臓器でのウイルス増殖を比較することで明らかにする。
マウスにおいてもデングウイルス、キメラウイルスの主な標的細胞は単球/マクロファージ及び樹状細胞であることを確認しているが、今後は、ヒト抹消血由来単核球を用いて、これら異なるウイルスが、どのヒト細胞を標的にするか、感染後のIFN, TNF-alphaなどのサイトカイン産生について各ウイルス間、マウスとの相違点を調べる。
抗体依存性感染増強（ADE）時に（１）ウイルス増殖の場が変化するか。（２）炎症性サイトカインのプロファイルが変化するかを確認する。FcgR（レセプター）欠損マウス及び抑制性FcgRIIBとIFN-R KOとを交配中であり、作成されればウイルスが良く増殖でき、しかもFcgR介在性の感染増強が起こらないもしくは制御異常を起こすマウスとなる。これらを用いることでADE現象による病態の詳細な解明を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
各実験系が確立され進行しているため、H25年度に比較的多くの予算を必要とするため、H24年度に一部残した研究費を今年度に使用する。研究費は飼育・使用するマウスが増えるため、維持費及び実験に必要な道具類・試薬類に使用する。これらの実験に伴うクローニング及び細胞培養、サイトカイン関連試薬、試薬類、フローサイトメトリー用標識抗体を購入するために使用する。特にウイルス検出にリアルタイムPCRを多用するため、H24年度から繰り越した研究費はH25年度の解析費用とする。マウス個体でウイルス増殖し、病原性を観察する感染系が確立でき、H25年度には病態解析を行うため、病理学的解析、免疫組織学的解析、血液学的検査などの試験項目が加わり、このための解析費用に使用する。さらにデングウイルス感染の鍵である抗体依存性感染増強（ADE）減少が観察されたことから、ADEによる感染条件での解析を進めるために抗体産生・精製費用が必要であり、ADE時の炎症性サイトカインのプロファイリングを行うための測定試薬を購入する。
また研究費は、これまでの成果を発表するための学会及び研究会参加にも使用する。複数の論文を準備中であるため、英文校正及び投稿料にも使用する。
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Research Products
(5 results)
