2014 Fiscal Year Annual Research Report
新規ペプチドベクターを用いたファブリー病マウスの遺伝子治療法の開発
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23590649
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
岩本 武夫 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (90568891)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2015-03-31
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| Keywords | 合成ペプチド / 新規ベクター / ファブリー病 / 遺伝子治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度最適化した条件で4.7kbのeGFP二重鎖プラスミドDNA(pDNA)をペプチドに加えナノペプチドカプセルの形態観察を大気圧電子顕微鏡で行ったが、数10nmのカプセルは見つからなかった。そこでモデリング法により直径20nmのカプセルに必要なペプチド数を計算した。また遺伝子の高発現が可能なモデルは一つのカプセルに一分子のpDNAが含くまれれば良い。この時のペプチドの陽イオン数(P)とDNAの陰イオン数(N)の電荷比(P:N)を計算すると65.5を示した。そこで電荷比65.5～0.65を示すぺプチドDNA複合体を調整しその溶液を透過型電子顕微鏡で観察した。電荷比10.4では密集したnano構造、電荷比65.5ではnanofiberが観察された。電荷比を調節すると異なる構造複合体が形成されるが、ペプチドカプセルは作られない事が判った。次に原子間力顕微鏡で電荷比10.4複合体のサイズを求めた結果高さ85nm横250nmを示した。複合体を精査するため調製試料を0.8％アガロースゲル電気泳動で解析した。電荷比2.6と10.4のバンドは負電荷が減ったため本来より上方にシフトし20.8は泳動されずペプチドがDNA表面を覆ったため臭化エチジウムは中に侵入できずバンドは検出できなかった。同様の理由でデオキシリボヌクレアーゼ-１を加えたがDNAの分解は起こらなかった。電荷比10.4の試料をヒーラー細胞に６ｈ培養し形質移入した細胞をFACSで測定した結果、高効率30％と無毒性を示した。複合体の細胞への取り込み方を調べるため細胞の温度調節と蛍光ラベルペプチドを用いて検討した結果、取り込みはエンドサイトーシスの温度依存的なプロセスで起こることが分かった。最高の遺伝子導入率を示した電荷比10.4の表面ゼータ電位を測定した結果は+5mVで、この値は陰極の細胞膜表面での相互作用を促進し細胞損害を与えるほど高値ではなかった。このように細胞にやさしく高効率な遺伝子導入法が構造解析の知見を得ることによって可能に成った。
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[Journal Article] Branched Amphiphilic Cationic Oligopeptides Form Peptiplexes with DNA: A Study of Their Biophysical Properties and Transfection Efficiency2015
Author(s)
L. Adriana Avila, Luana R. M. M. Aps, Pinakin Sukthankar, Nicoleta Ploscariu, Sushanth Gudlur, Ladislav Šimo, Robert Szoszkiewicz, Yoonseong Park, Stella Y. Lee , Takeo Iwamoto, Luis C. S. Ferreira, John M. Tomich
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Journal Title
Molecular Pharmaceutics
Volume: 12
Pages: 706-715
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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