2012 Fiscal Year Research-status Report
ストレス負荷により痛覚過敏が生じる脳メカニズムの解明
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23590717
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
井辺 弘樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60326353)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 晃久 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (20225022)
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| Keywords | ストレス / 疼痛学 / 下行性疼痛調節系 |
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| Research Abstract |
１．慢性ストレス後の痛覚過敏の発現・維持に下行性疼痛調節系からのセロトニン入力が関与していることを明らかにするため、RatTph2 遺伝子断片(もしくはスクランブル配列)を含む short hairpin RNA (shRNA) プラスミドをエレクトロポレーション法を用いてラットの吻側延髄腹内側部（RVM）に遺伝子導入を試みた。刺激電極の形状を変化させ、電気刺激の加え方を改善して、現在、適切な刺激条件を探っている。
２．慢性ストレス負荷後、脳を摘出し、グリア細胞関連 タンパク質( GFAP, CD11b ) などの Western blot を用い、タンパク量を測定しコントロール群と比較した。慢性ストレス負荷後、中脳中心灰白質 (PAG) において GFAP およびグリアグルタメートトランスポーター（EAAT2）の有意な減少が確認された。免疫組織染色において、GFAP の減少は VLPAG において著明であることが明らかとなった。これら結果は、第35回日本神経科学大会、第105回近畿生理学談話会において報告し、論文として掲載された（Neuroscience 223: 209-218, 2012）。
３．コントロール、強制水泳ストレス負荷ラットの足底に CFA を注射し、疼痛反応を測定した。強制水泳ストレス負荷により、疼痛反応の有意な増強が確認された。さらに、強制水泳ストレス負荷により、大脳皮質の一部で p-CERB および c-Fos の発現が有意に増加することが明らかとなり、現在、さらに検討を加えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
慢性ストレス負荷後、下行性疼痛調節系の重要な構成要素である中脳中心灰白質 (PAG) において、アストロサイトのマーカーであるGFAP および グルタメートトランスポーターの有意な減少を確認することができた。関連する学会において発表を行い、データーをまとめ、論文として掲載された。同様に、吻側延髄腹内側部（RVM）においても学会に発表を行い、論文を投稿中である。研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．shRNA プラスミドをラットの吻側延髄腹内側部（RVM）に遺伝子導入し、RNA 干渉により TPH の遺伝子発現を抑制する。下行性セロトニン入力を低下させたラットでストレス負荷により生じる痛覚過敏が変化するか否か検討する。
２．慢性ストレス負荷後、RVM において、グリア細胞関連タンパク質( GFAP, CD11b, S100beta ) などの Western blot を用い、タンパク量を測定しコントロール群と比較する。有意差が確認されたタンパク質に対しては免疫組織染色を行い、画像上どの領域で変化が著明であるのか、組織学的検討を加える。
3．コントロール、強制水泳ストレス負荷ラットの足底に CFA を注射し、大脳皮質に加えて、RVM や 青斑核（LC）などでの p-CERB、c-fos、delta-fosB の発現を免疫組織学的に調査する。そして、それらマーカータンパク質の発現量と behavior の相関を調査する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
遺伝子導入に使用するshRNA プラスミドは海外の業者に注文・輸入するため高価である。それらを大腸菌にトランスフェクションし増幅後、プラスミドを回収するためのキットが必要となる。プラスミドの脳内微量注入のために、プラスミドの種類・濃度に応じて多くの特殊なマイクロシリンジ・チューブの購入が必要である。
Western blot に関して、抗体、ゲル板、メンブレン、化学発光キットの購入が必要である。
c-fos、delta-fosB などマーカーを用いた組織学的な神経活動の評価に各種一次抗体、二次抗体、多くの免疫染色キットの購入が必要である。
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