循環調節ペプチドー脳性利尿ペプチド、アドレノメデュリンーの展開研究

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23591041
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 錦見 俊雄 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80291946)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桑原 宏一郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30402887) ; 中川 靖章 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70452357)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: BNP / アドレノメデュリン / 糖鎖 / 心不全

Research Abstract

1. proBNPは血中に多く含まれ、現在のBNPの測定系ではproBNPも交叉している事が判明している。2010年の我々の報告ではproBNPをC18カラム抽出、ゲル濾過法、免疫蛍光法を組み合わせて測定していたが、この方法ではproBNP測定に数日かかり、多くの検体も処理出来ない。臨床応用には、２つの特異的なモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法で血漿を直接測定する系を完成する必要がある。サンドイッチ法を利用した、非競合的免疫蛍光法を用いたproBNPの測定系開発を行った。最低測定限界値が（0.4 pM）で、血漿から約７時間で測定できる系で、CV値10%以下であった。2. BNPの分子型の決定にはproBNPのcorin、furin などのprocessing酵素が重要な働きをしている可能性がある。新生仔ラット心臓の心筋培養を行い、細胞内液とメディウムを採取し、BNP分子型の測定を行った。さらにこのcorin、furinのsiRNAを用いて遺伝子のノックダウンを行い、processingとの関係を検討した。proBNPのprocessingにはfurinが関係していることが示唆された。3.ラット心筋細胞にヒトproBNP遺伝子をレンチウイルスを用いて遺伝子導入し、培養液中のproBNP/BNP比を測定することにより、ヒトproBNPのプロセシングを評価した。またproBNPのO型糖鎖付着部位であるThr, Ser残基をAlaに変えた遺伝子変異体を作成し、どこの糖鎖付着がprocessingに影響をもつのかを評価した。その結果、71Thへの糖鎖の付着がprocessingに重要である事が示された。4.アドレノメデュリンのコンディショナルKOマウスを作成し検討予定で、現在floxマウスの樹立に成功しaP2をプロモーターにCreを過剰発現したマウスに掛け合わせている所である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

達成度はほぼ良好である。「ヒト血漿における糖鎖結合型proBNPと非結合型proBNPの分離測定系の構築」をもうけていたが、我々の現在のゲル濾過と新しい測定系の解析を組み合わせた検討からは、ヒト血漿では殆どがproBNPは糖鎖結合している事が示された。従って、この測定系を構築しても意味が少ないという事で、proBNPの簡便な測定系の構築に変更した。新たな課題も見つかり、今後進めていく予定である。processing酵素の同定に関しても、ほぼ順調に進んで、proBNPのprocessingにはfurinが関係しているという成果が得られた。一方、proANPのprocessingにはfurinが関係していた。糖鎖とproBNPのprocessingに関した研究も順調に運び、71Thへの糖鎖の付着がprocessingに重要であるという結果が得られた。これだけではすべを説明出来ず、他の場所に対する糖鎖付着の影響を継続して検討している。アドレノメデュリンのコンディショナルKOマウスの作成に関しては、ようやくfloxマウスの樹立に成功し、今後aP2をプロモーターにCreを過剰発現したマウスに掛け合わせて、解析予定である。

Strategy for Future Research Activity

proBNPのN端に糖鎖が付着しこれがprocessingに関係する事が明らかとなった。特に71Thrへの糖鎖付着が重要である事が判明した。また71Thだけではすべてを説明出来ないことも判明したので、本年度は、他のどの場所への糖付着がproBNPのprocessingに大事かを検討する。糖鎖が全くつかない変異体も同時に作成し、糖鎖の意義をより証明していく予定である。同時に、これらの場所への糖転移酵素の同定も試みる。現在、いくつかの糖転移酵素に絞り込めており、siRNA等を用いて検討予定である。ヒト心不全の研究ではproBNPの測定系が出来たので、proBNPの比率が高い心不全はどのような特徴を有するのかを臨床的に詳細に検討する。さらにproBNPと腎機能や年令、性、肥満との関係なども詳細に検討予定である。可能であれば心臓カテーテル時に種々の場所から採血を行い、proBNPの全身での代謝と意義について検討する。アドレノメデュリンもようやくFloxマウスができたので、aP2をpromotorにCreを過剰発現したマウスと掛け合わせ、脂肪細胞特異的なKOマウスを作成し、糖代謝、脂質代謝等への影響を見ていく予定である。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

proBNPへの糖鎖の付着とprocessingとの関係では、心筋細胞の培養系で評価を行っているので、新生仔ラットの購入、FCS、プラスチック器具などなど細胞培養に必要な種々の消耗品、分子生物学に必要な試薬、消耗品が必要である。また糖転移酵素の同定には種々のsiRNAを用いた検討を考えており、この購入費用、リアルタイムPCRに必要なプライマーも必要である。ヒト心不全のproBNPの研究では測定に必要なプラスチック器具や、消耗品、さらに同時に評価を予定しているcGMP、ANP等の外注費用（試薬を購入して測定するよりも、費用はほぼ同じで、労力が省ける）が必要である。アドレノメデュリン細胞特異的なKOマウスの研究では、糖代謝、脂質代謝等への影響を見ていく予定なので、これらを測定する試薬、kitの購入、マウスの飼育費用などに当てる予定である。さらにこれらの研究結果を国内外の学会で発表予定であるので、これに必要な旅費にも充てる予定である。

Research Products

• [Journal Article] The effect of glycosylation on plasma N-terminal proBNP-76 levels in patients with heart or renal failure (2012)
  • Author(s): Nishikimi T, Ikeda M, Takeda Y, Ishimitsu T, Shibasaki I, Fukuda H, Kinoshita H, Nakagawa Y, Kuwahara K, Nakao K
  • Journal Title: Heart Volume: 98 Pages: 152-161
  • DOI: 10.1136/heartjnl-2011-300102
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 心疾患のバイオマーカーとしてのBNPの臨床的意義―基礎的臨床的観点からー (2012)
  • Author(s): 錦見俊雄
  • Journal Title: 日本臨床 Volume: 70 Pages: 774-784
• [Journal Article] Diverse molecular forms of plasma B-type natriuretic peptide in heart failure. (2011)
  • Author(s): Nishikimi T, Minamino N, Nakao K
  • Journal Title: Curr Heart Fail Rep Volume: 8 Pages: 140-146
  • DOI: 10.1007/s11897-011-0051-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Current biochemistry molecular biology, and clinical relevance of natriuretic peptides. (2011)
  • Author(s): Nishikimi T, Kuwahara K, Nakao K.
  • Journal Title: J Cardiol. Volume: 57 Pages: 131-140
  • DOI: 10.1016/j.jjcc.2011.01.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Japanese-Western consensus meeting on biomarkers (2011)
  • Author(s): Maisel AS, Nakao K, Ponikowski P, Peacock WF, Yoshimura M, Suzuki T, Tsutamoto T, Filippatos GS, Saito Y, Seino Y, Minamino N, Hirata Y, Mukoyama M, Nishikimi T, Nagai R
  • Journal Title: Int Heart J. Volume: 52 Pages: 253-265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Zinc-finger protein 90 negatively relulates neuron-restrictive silencer factor-mediated transcriptional repression of fetal cardiac genes (2011)
  • Author(s): Hata L, Murakami M, Kuwahara K, Nakagawa Y, Kinoshita H, Usami S, Yasuno S, Fujiwara M, Kuwabara Y, Minami T, Yamada Y, Yamada C, Nakao K, Ueshima K, Nishikimi T, Nakao K
  • Journal Title: J Mol Cell Cardiol. Volume: 5 Pages: 972-981
  • DOI: 10.1016/j.yjmcc.2011.01.017
  • Peer Reviewed
• [Presentation] BNP関連ペプチドの最新知見 (2012)
  • Author(s): 錦見俊雄
  • Organizer: The76th Annual Scientific Meeting of The Japanese Circulation Society
  • Place of Presentation: 国際会議場（福岡）
  • Year and Date: 2012 March 16-18 2012
• [Presentation] Increased HCN channels in failing hearts possibly contribute to ventricular arrhythmias (2012)
  • Author(s): Y Kuwabara, K Kuwahara, M Takano, H Kinoshita, Y Nakagawa, S Usami, S Yasuno, K Nakao, T Minami, Y Yamada, J Shibata, T Nishikimi, K Ueshima and K Nakao
  • Organizer: The76th Annual Scientific Meeting of The Japanese Circulation Society
  • Place of Presentation: 国際会議場（福岡）
  • Year and Date: 2012 March 16-18 2012
• [Presentation] MRTF-A, a rho-dependent co-activator of SRF, plays a critical role in vascular remodeling by regulating smooth muscle cell migration (2012)
  • Author(s): T Minami, K Kuwahara, J Shibata, C Yamada, Y Kuwabara, K Nakao, H Kinoshita, S Usami, S Yasuno, Y Nakagawa, K Ueshima, T Nishikimi, M Takaoka, M Sata, R Nagai, K Nakao
  • Organizer: The76th Annual Scientific Meeting of The Japanese Circulation Society
  • Place of Presentation: 国際会議場（福岡）
  • Year and Date: 2012 March 16-18 2012
• [Presentation] TRPC3/6 Ion Channels as Potentially Novel Therapeutic Targets against Pulmonary Arterial Hypertension (2012)
  • Author(s): H Kinoshita, K Kuwahara, S Kiyonaka, Y Mori, J Shibata, C Yamada, T Minami, K Nakao, Y Kuwabara, S Yasuno, S Usami, Y Nakagawa, T Nishikimi, K Ueshima, K Nakao
  • Organizer: The76th Annual Scientific Meeting of The Japanese Circulation Society
  • Place of Presentation: 国際会議場（福岡）
  • Year and Date: 2012 March 16-18 2012
• [Presentation] Inhibition of HCN overexpression in failing heart of dilated cardiomyopathy mouse model by ivabradine prevents sudden arrhythmic death (2011)
  • Author(s): Y Kuwabara, K Kuwahara, H Kinoshita, M Takano, Y Nakagawa, S Usami, K Nakao, T Minami, Y Yamada, C Yamada, J Shibata, T Nishikimi1, K Ueshima and K Nakao
  • Organizer: American Heart Association Scientific Session 2011
  • Place of Presentation: Convention Center(Orlando, USA)
  • Year and Date: Nov 12-16, 2011
• [Presentation] N-Type Ca2+ Channel Blocker is Effective to Prevent Sudden Cardiac Death in Mice with Heart Failure (2011)
  • Author(s): Y Yamada, K Kuwahara, H Kinoshita, Y Kuwabara, Y Nakagawa, J Shibata, C Yamada, T Minami, S Yasuno, S Usami, K Nakao, T Nishikimi, K Ueshima,
  • Organizer: American Heart Association Scientific Session 2011
  • Place of Presentation: Convention Center(Orlando, USA)
  • Year and Date: Nov 12-16, 2011
• [Presentation] Induction of Myocardin-Related Transcription Factor-A Contributes to the Phenotypic Alteration of Vascular Smooth Muscle Cells and Plays a Pivotal Role in Vascular Remodeling (2011)
  • Author(s): T Minami, K Kuwahara, Y Nakagawa, H Kinoshita, K Nakao, Y Kuwabara, Y Yamada, C Yamada, J Shibata, S Usami, T Nishikimi, K Nakao
  • Organizer: American Heart Association Scientific Session 2011
  • Place of Presentation: Convention Center(Orlando, USA)
  • Year and Date: Nov 12-16, 2011
• [Presentation] Analysis of circulating glycosylated N-terminal-proBNP and nonglycosylated N-terminal proBNP in patients with heart failure (HF) and chronic renal failure (CRF) on hemodialysis (2011)
  • Author(s): T Nishikimi, M. Ikeda, Y Takeda, T Ishimitsu, N Minamino, K Kuwahara, H Kinoshita, Y Nakagawa, K Nakao
  • Organizer: ESC Congress 2011
  • Place of Presentation: Convention Center(Paris, France)
  • Year and Date: 2011 8 – 27-31
• [Presentation] BNP遺伝子発現調節領域におけるserum response factor応答領域の新たなる同定とその心筋細胞肥大反応における意義 (2011)
  • Author(s): 桑原宏一郎・木下秀之・桒原佳宏・中川靖章・南 丈也・山田千夏・柴田純子・宇佐美覚・錦見俊雄・中尾一和
  • Organizer: 第15回日本心血管内分泌学会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター（大阪）
  • Year and Date: 2011 11月25-26日
• [Presentation] 病的血管リモデリングでみられる血管平滑筋細胞形質転換におけるRho依存性転写共役因子MRTF-Aの意義 (2011)
  • Author(s): 南 丈也・桑原宏一郎・中川靖章・木下秀之・中尾一泰・桒原佳宏・山田千夏・柴田純子・宇佐美覚・錦見俊雄・中尾一和
  • Organizer: 第15回日本心血管内分泌学会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター（大阪）
  • Year and Date: 2011 11月25-26日
• [Presentation] ANP・BNP遺伝子発現調節因子NRSFにより制御されるHCNチャネルの心不全モデルマウスにおける突然死発症への関与 (2011)
  • Author(s): 桒原佳宏，桑原宏一郎，木下秀之，鷹野誠，中川靖章，宇佐美覚，柴田純子，山田千夏，南丈也，山田優子，藤原正隆，保野慎治，錦見俊雄，上嶋健治，中尾一和
  • Organizer: 第15回日本心血管内分泌学会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター（大阪）
  • Year and Date: 2011 11月25-26日
• [Presentation] 高血圧性左室肥大・潜在性心機能低下のサロゲートマーカーとしての血漿BNP測定の意義と問題点 (2011)
  • Author(s): 錦見俊雄
  • Organizer: 第34回日本日本高血圧学会総会
  • Place of Presentation: 栃木文化センター（栃木）
  • Year and Date: 2011 10月20-22
• [Presentation] 拡張型心筋症・不整脈死モデルマウスにおけるN型Ca2+チャネル阻害の有用性の検討 (2011)
  • Author(s): 山田優子、桑原宏一郎、木下秀之、桑原佳宏、中川靖章、柴田純子、山田千夏、南丈也、保野慎治、宇佐美覚、中尾一泰、錦見俊雄、上嶋健治、森泰生、中尾一和
  • Organizer: 第34回日本日本高血圧学会総会
  • Place of Presentation: 栃木文化センター（栃木）
  • Year and Date: 2011 10月20-22