2012 Fiscal Year Research-status Report
冠攣縮性狭心症の成因に関する分子生物学的研究：Ｐ１２２蛋白の役割の確立
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23591077
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
奥村 謙 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20185549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長内 智宏 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00169278)
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| Keywords | 循環器・高血圧 / 冠孿縮 / P122蛋白 / Phospholipase C / R257H亜型PLC-δ1 |
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| Research Abstract |
【背景・目的・方法】我々は冠攣縮性狭心症（CSA）患者の培養皮膚線維芽細胞膜分画Phospholipase C（PLC）活性が亢進し、PLC活性と冠動脈の収縮性が正相関を示し、その主体がPLC-δ1であることを報告した（J Am Coll Cardiol 2000）。本研究ではPLC-δ1活性を制御するp122（DLC1）蛋白に着目し、CSA患者のp122遺伝子および蛋白発現を検討した。また、PLC活性を亢進させるヒトR257H亜型PLC-δ1を血管平滑筋特異的に過剰発現させたマウス（PLC-TG）を作成し、冠攣縮誘発性を検討した。さらにPLC-TGに対してCa拮抗薬（ジルチアゼム）を投与し、冠攣縮誘発性に及ぼす影響について検討した。
【結果】CSA患者から採取された培養皮膚線維芽細胞においてp122遺伝子発現と蛋白発現がコントロール例に比して有意に亢進していた。PLC活性との関連を見ると、大動脈平滑筋細胞にp122蛋白を過剰発現させるとPLC活性が亢進し、さらにアセチルコリン刺激に対する細胞内カルシウムイオン濃度が上昇していた。一方、PLC-TGマウスの冠動脈、大動脈ならびに腸間膜動脈のPLC活性が野生型と比べて有意に亢進しており、エルゴメトリン投与により心電図ST上昇ならびに高度房室ブロックが観察された。ランゲンドルフ灌流実験では、PLC-TGマウスの冠動脈灌流圧は野生型に比してエルゴノビン投与により有意に上昇した。Ca拮抗薬はPLC-TGにおける冠攣縮誘発を抑制した。
【結論】①PLC-δ1活性亢進の機序の一つとしてp122蛋白の発現亢進が示唆された。②PLC-TGマウスは、臨床例に近似したCSA動物モデルと考えられた(Circulation 2012)。③ジルチアゼムは本PLC-TGマウスにおける冠攣縮誘発阻止に有効であり、臨床例と同じフェのタイプであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
p122蛋白はPLC-δ1活性を亢進させる調節因子でありが、冠攣縮性狭心症患者から得られた培養皮膚線維芽細胞においてp122遺伝子発現と蛋白発現が亢進していること、ヒト冠動脈平滑筋細胞において、p122蛋白過剰発現によりPLC活性が亢進し、アゴニスト刺激に対する細胞内カルシウムイオンが上昇すること、さらにp122遺伝子の5’側promoter解析により、-228G/Aならびに-228A/A変異が冠攣縮性狭心症男性患者の約10%で認められ、それらの変異によりpromoter活性が亢進することを明らかにした(Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010)。
PLC活性を亢進させるヒトR257H亜型PLC-δ1（Circulation 2002）を血管平滑筋特異的に過剰発現させたマウスを作成した（PLC-TG）。このマウスの冠動脈、大動脈ならびに腸間膜動脈ではPLC活性が野生型マウスと比べて有意に亢進していること、PLC-TGマウスにアゴニスト（エルゴメトリン）を投与すると体表面心電図にてST上昇ならびにそれに続く高度房室ブロックが誘発されること、Microvascular filling法によりアゴニスト刺激による冠動脈攣縮が誘発されること、ランゲンドルフ灌流実験においてPLC-TGマウスの冠動脈潅流圧は野生型に比してエルゴノビン投与後に有意に上昇することを明らかにした。PLC-TGマウスは、臨床例に近似した冠攣縮性狭心症動物モデルであると考えられた(Circulation 2012)。以上の研究成果より、本研究は順調に進展していると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.PLC-TGマウスで観察された冠攣縮に及ぼすカルシウム拮抗薬の影響の検討: 我々が作成したPLC-TGマウスを用いて、エルゴノビン投与により誘発された冠攣縮がカルシウム拮抗薬の投与により抑制されるかどうかを、心電図変化(心拍数やST-T変化、房室ブロック)により検討する。
2.細胞内カルシウムイオンの反応性におけるAKAP79/150とPKCの役割：in vitroにおける検討: HEK-293細胞に正常PLC-δ1とムスカリンM1受容体遺伝子をtransfection後、アセチルコリン刺激に対する細胞内遊離カルシウムイオンの反応性について、fura-2を使用し分光蛍光光度計にて測定する。細胞内遊離カルシウムイオンの反応性におけるAKAP79/150の役割を検討するため、AKAP79/150発現をsiRNA法により抑制し、同様の方法にて細胞内遊離カルシウムイオンを測定する。AKAP79/150とPKCの細胞内遊離カルシウムイオンの反応性に及ぼす影響、特に細胞外からのカルシウムイオン流入におけるAKAP79/150とPKCの役割を検討する。
3.冠攣縮におけるAKAP79/150の役割：in vivoにおける検討: AKAP-KOマウスを米国MMRRC（Mutant Mouse Regional Resource Center）より購入中である。PLC-TGマウスとAKAP-KOマウスを交配し、PLC-δ1過剰発現AKAP-KOマウス(PLC-AKAPマウス)を作成する。大動脈、心臓、腎臓のL型カルシウムイオンチャネル、PLC-δ1、AKAP79/150の遺伝子発現ならびに蛋白発現をReal-time PCR法ならびにWestern blotting法にて検討する。また各臓器の組織像についての検討も併せて行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
1.PLC-TGマウスで観察された冠攣縮に及ぼすカルシウム拮抗薬の影響の検討
マウスの管理維持費用、試薬および薬剤購入費用として使用する。
2.①細胞内カルシウムイオンの反応性におけるAKAP79/150とPKCの役割：in vitroにおける検討②HEK-293細胞購入費用、試薬および薬剤購入費として使用する。
3.冠攣縮におけるAKAP79/150の役割：in vivoにおける検討
AKAP-KOマウス購入費用、試薬および薬剤購入費として使用する。
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[Journal Article] Re-elevation of T-wave from day 2 to day 4 after successful percutaneous coronary intervention predicts chronic cardiac systolic dysfunction in patients with first anterior acute myocardial infarction.2013
Author(s)
Nishizaki F, Tomita H, Yokoyama H, Higuma T, Abe N, Suzuki A, Endo T, Tateyama S, Ishida Y, Osanai T, Okumura K.
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Journal Title
Peer Reviewed
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[Journal Article] Br-DIF-1 accelerates dimethyl sulphoxide-induced differentiation of P19CL6 embryonic carcinoma cells into cardiomyocytes.2012
Author(s)
Seya K, Kanemaru K, Matsuki M, Hongo K, Kitahara H, Kikuchi H, Oshima Y, Kubohara Y, Okumura K, Motomura S, Furukawa KI.
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Journal Title
Br J Pharmacol.
Volume: 165
Pages: 870-879
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Coronary Vasospasm Induced in Transgenic Mouse With Increased Phospholipase C-δ1 Activity.2012
Author(s)
Shibutani S, Osanai T, Ashitate T, Sagara S, Izumiyama K, Yamamoto Y, Hanada K, Echizen T, Tomita H, Fujita T, Miwa T, Matsubara H, Homma Y, Okumura K.
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Journal Title
Circulation.
Volume: 28
Pages: 1027-1036
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Overexpression of coupling factor 6 attenuates exercise-induced physiological cardiac hypertrophy by inhibiting PI3K/Akt signaling in mice.2012
Author(s)
Sagara S, Osanai T, Izumiyama K, Shibutani S, Hanada K, Yokoyama H, Yamamoto Y, Yokota T, Tomita H, Magota K, Okumura K.
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Journal Title
J Hypertens.
Volume: 30
Pages: 778-786
DOI
Peer Reviewed
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