2012 Fiscal Year Research-status Report
アクチンミオシン結合蛋白トランスジェニックマウスにおける間質性肺炎の検討
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23591135
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
古賀 康彦 群馬大学, 医学部, 助教 (10533862)
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| Keywords | ミオシン / p116Rip / 気道上皮 / 間質性肺炎 / リン酸化 / トランスジェニックマウス |
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| Research Abstract |
細胞運動機能の引き金となるミオシンのリン酸化は、ミオシンリン酸化酵素(MLCK)とミオシン脱リン酸化酵素(MLCP)の相対的酵素活性 バランスにより制御を受けている。ミオシンリン酸化の新たなメカニズムとして同定された、MLCPの一分子であるMYPT1の新たな結合 蛋白質のp116Ripは、RhoA、MLCPと結合することによって、RhoAを不活化しMLCP活性を上昇させ、その結果として細胞内のミオシンの リン酸化を抑制的に制御していた。
p116Ripが肺由来のヒト繊維芽細 胞(HFL-1)及び、ヒト気道上皮細胞(HBEC-3)の培養細胞のみならずヒト平滑筋細胞(ASMc)を用いてp116Ripのタンパク発現の検討を特 異的抗体を使用したウエスタンブロット法にて行った。さらにp116Ripに対する特異的siRNAを使用してHFL-1及び、HBEC-3、ASMc細胞 内におけるp116Ripのgene silencingの検討を行った。いずれの細胞株においてもp116Ripが発現しており、かつp116Rip siRNAを用い る事によって特異的に効率よくp116Ripの蛋白発現がknock downされることが判明した。そして、p116Ripのgene silencingに伴い、ミ オシンのリン酸化が上昇している事もウェスタンブロット法により判明した。
In vitroだけでなくin vivoにおいてのp116Ripの役割を 解明するために、p116Ripの全身過剰発現型モデルマウス(トランスジェニックマウス)の作製を行い、それらマウスを使用してブレオマイシンマウスに及ぼす影響 をwild typeと比較検討を行っている。
また気道培養細胞を使用して、p116Ripのgene silencingのサイトカイン分泌に及ぼす影響を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
トランスジェニックマウスの実験において、ブレオマイシンマウスを作成し週令数を合わせながら実験を行ってきた。マウスを使用した実験は元々時間のかかる作業であ り、かつ培養細胞よりも予想できない進展状況となるため、週令数を合わせたマウスが死亡してしまうなどの事態もあったが、in vivoの実験系に関しては予想された範囲内の進展状況と思われる。
培養細胞を使用した実験では予定していた実験を進めている状況であるが、サイトカイン分泌の測定系の確率が困難で実験を繰り返し行っているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
週例数のそろったブレオマイシンマウスに対して、肺組織を使用してのコラーゲンやp116Ripなどの免疫染色や肺の繊維化の程度などへの 影響を検討していく。気道培養細胞を使用してp116Ripのgene silencingを行いながらTGF-betaやTNF-alfaなどの刺激を加えて培養細胞からの炎症性サイ トカインの分泌に及ぼす影響に対する結果を出し、in vitroとin vivoでの結果の統合的な実験ならびに解析を進めていく予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
動物モデルを使用した実験系では複数年度にわたる長期的な実験計画が必要であり、それらの実験の結果とin vitroでの結果の構築によってより信頼性のある実験データが得られる。平成24年度は、マウスの繁殖とトランスジェニックマウスの週令数の調整に困難を極めたため、その先の実験などに要する実験費が平成25年度に持ち越すこととなった。そのため次年度は、繰り越し金の970,000円弱と平成25年度の800,000円の研究費を申請しており、追実験の蓄積、実験結果のまとめならびに、論文構築や動物飼育、実験試薬などにそれら研究費をあてていく予定である。
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Research Products
(1 results)
