間質性肺炎における血管新生関連因子の機能解析と臨床応用

2012 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23591164
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 功刀 しのぶ 日本医科大学, 医学部, 講師 (30350036)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福田 悠 日本医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60097037) ; 寺崎 泰弘 日本医科大学, 医学部, 准教授 (50332870)
• Keywords: 間質性肺炎 / microRNA / exosome / multivesicular body

Research Abstract

①ブレオマイシン肺炎モデルを作成し、正常肺と線維化期及び上皮の増生が見られたブレオマイシン投与後２１日目(Day21)を比較対象とし、肺と気管支肺胞洗浄液の他、血清と肺以外の臓器（肝臓、腎臓、脾臓）を採取した。
凍結血清の他、肺と肺以外の臓器凍結検体、4%PFA固定標本の作製の他、グルタール固定標本を作成した。
正常肺、線維化期Day21でのII型肺胞上皮細胞質内のmultivesicular bodyを電子顕微鏡的に確認を行った。
５匹のマウス肺組織から、気管支肺胞洗浄液を採取する他、肺組織をホモジェナイズしLamellar body分画の抽出する事を追加した。
②気管支肺胞洗浄液は、肺胞洗浄液全体からのmicroRNAの抽出を行うだけではなく、超遠沈を行い、電子顕微鏡の一つの手法であるnegative stainingを用いて分画を形態的に確認しながら、lamellar body分画とexosome分画に分けた。気管支肺胞洗浄液のmicroRNAの解析において、肺組織でのmicroRNAの解析とそれとの対比を行うが、血清とその他の臓器でのmicroRNAの発現を比較し、気管支肺胞洗浄液、血清で肺特異的microRNAを検索できるように検体を採取した。また、気管支肺胞洗浄液に存在するexosomeの由来を検索するため、exosomeのマーカー(CD63）と由来と考えられる組織球マーカー、ＩＩ型上皮のマーカー(SP-Ａ，SP-C)に対する抗体を用いて免疫電顕を行い、由来の同定を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

①気管支肺胞洗浄液からexosome分画の抽出はこれまで論文はなく、Lamellar body分画の抽出を参考にし、電子顕微鏡的に分画の形態を確認しながら、exosome分画の抽出の手法を確立した。マウスの気管支肺胞洗浄液一匹あたり1.5ml程度と少なく、気管支肺胞洗浄液からexosome分画を抽出するには、過去のLamellar body分画の抽出を応用し、５匹を必要とし、形態の確認に電子顕微鏡を必要とするため、検体の採取と抽出方法の確立に時間がかかった。
②血液由来のmicroRNAは溶血の影響をうけるため、溶血の影響のないように血液の採取と処理を行う手法の確立にも時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

①前年度採取した凍結肺組織からmicroRNAの網羅的解析を行う。
②その中から、変化のあったmicroRNAのついて、気管支肺胞洗浄液、気管支肺胞洗浄液から抽出したLamellar body分画、exosome分画、血清、その他の臓器での発現を対比する。
③組織でのmicroRNAのin situ hybridizationを行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

①免疫電顕に用いる抗体購入　10万円　②microRNA のin situ hybridizationのprobe購入35万円

Research Products

• [Journal Article] Granuloma-forming interstitial pneumonia occurring one year after the start of everolimus therapy (2013)
  • Author(s): Saito Y, Kunugi S, Suzuki Y, Narita K, Miura Y, Minegishi Y, Kimura G, Kondo Y, Azuma A, Fukuda Y, Gemma A
  • Journal Title: Internal Medicine Volume: 52 Pages: 263-267
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.52.8588
  • Peer Reviewed