2011 Fiscal Year Research-status Report

肺サーファクタント輸送異常による間質性肺炎の病態解明

Research Project

Project/Area Number	23591165
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	長内和弘金沢医科大学, 医学部, 教授 (70221158)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	井口晶晴金沢医科大学, 医学部, 講師 (60350758) 小林誠金沢医科大学, 医学部, 助教 (20460355)
Project Period (FY)	2011-04-28 – 2014-03-31
Keywords	肺サーファクタント / 肺胞II型上皮細胞 / 細胞内輸送異常 / 間質性肺炎
Research Abstract	1）分化機能を維持した肺胞II型上皮細胞(II型細胞)初代培養系の確立。　II型細胞株や培養ディッシュに培養した単離II型細胞は脱分化し、肺サーファクタントの研究には使用できない。そこでコントロールのSD, ヘルマンスキー・パドラック症候群モデルであるRab38低分子量Gタンパク質欠損FHラットからエラスターゼ消化およびメトリザマイド密度勾配遠心法にてII型細胞を単離し、これをマトリゲル膜上に培養し、途中から上皮側を気相にして、II型細胞を培養する方法を確立した。II型細胞の分化機能はSP-A, SP-B, SP-Dの発現をリアルタイムPCRで確認し、SP-Aの発現はウェスターンブロットで確認した。2）II型細胞内肺サーファクタント輸送の解析。　II型細胞内におけるサーファクタント輸送を小胞体からゴルジ装置)への小胞輸送をインヒビターであるブレフェルジンAを用いて解析した。また細胞分画法およびスクロース密度勾配遠心法により層状封入体を単離した。サーファクタント成分のうちPCは[3H]コリンでラベルしシリカゲル薄層クロマトグラフィー法で定量した。SP-AとSP-Bは[35S]メチオニンでアイソトープラベルし、特異抗体を用い免疫沈降法により新合成サーファクタント成分の輸送を解析した。これによりサーファクタントの層状封入体への輸送、細胞外への分泌を検討したところ各サーファクタント成分の細胞内輸送経路はいずれも異なった経路を取ることが明らかになった。3)　ラットSP-C-cDNAの作成とアデノベクターへの組込み。SDラット単離II型細胞より総RNAを抽出し、RT-PCRを用いてSP-C-cDNAを作成した。リアルタイムPCR法によりSP-A,　SP-B,　SP-C,　SP-Dの発現を解析した。アデノベクターに野生型Rab38および変異型Rab38を組み込みHEK293細胞で増幅させた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 交付申請書に記載した平成23年度計画の内容の約80％は達成した。一部肺サーファクタントプロテインC（SP-C）のクローニングと変異導入が予定よりやや遅れているが、まもなく達成予定である。
Strategy for Future Research Activity	変異SP-Cのクローニングは次年度に持越し、まずこれを達成する。その上で同変異SP-Cを強制発現させたII型上皮細胞における肺サーファクタント輸送と遺伝子発現、およびヘルマンスキー・パドラック症候群モデルラット(Fown-hooded rat)での肺病変および肺サーファクタント輸送・分泌を研究計画書通りに検討する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	次年度研究費は次年度研究計画書通り変異SP-C強制発現細胞での解析、Fown-hooded ラットでの解析に使用する。