筋強直性ジストロフィー症における中枢神経スプライシング異常の分子機序の解明

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23591258
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 木村 卓 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (20441264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 芳川 浩男 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (90273680) ; 久保 秀司 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (10441320)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: 国際情報交流 / 米国、フロリダ大学

Research Abstract

「DM1患者およびノックアウトマウス（MBNL１並びにMBNL２）の脳におけるスプライシング異常プロファイルの作製」として、我々は、Swanson教授（米国、フロリダ大学）から、MBNL1/MBNL2それぞれのノックアウトマウス脳でのexon arrayを用いた新規スプライシング異常の全データを供与された。このデータを基に、DM1患者脳・MBNL1ノックアウトマウス脳で共通する３個の、DM1患者脳・MBNL2ノックアウトマウス脳で共通する10個の新規スプライシング異常を見出した。また脳内で側頭葉と小脳ではスプラシング異常の程度が異なっていた。MBNL2ノックアウトマウスではDM1患者で見られる認知機能障害、睡眠障害が認められた。「脳各部位でMBNL1/2蓄積などの各種パラメーターの検討」としては、正常マウス脳、ヒト剖検脳を用いてWestern blot法により、脳の各部位でのMBNL1発現量を検討した。側頭葉、小脳、海馬でMBNL1発現量に明らかな差異は認められなかった。小脳と側頭葉でDMPK遺伝子のCTGリピートは明らかに異なっていることが報告されており、我々の検体でも確認された。現時点でスプライシング異常の程度の差異はCTGリピート数の影響が大きいと考えられた。「スプライシング異常の培養細胞での再現、治療可能性の検討」としては、マウス奇形腫由来P19細胞神経系分化におけるCaMK2dのスプライシングパターンを再現することができた。我々はレンチウイルスを用いて、延長したCTGリピートを含むDMPK遺伝子を、この細胞に発現させると、スプライシングパターンの分化による変化が見られなくなることを見出した。次にレンチウイルスを用いてMBNL1遺伝子を過剰発現させ、スプライシングパターンを正常化させることができるかを検討したが、正常化させることはできなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「DM1患者およびノックアウトマウス（MBNL１並びにMBNL２）の脳におけるスプライシング異常プロファイルの作製」については、当初はトランスジェニック社で作製されたMBNL2ノックアウトマウスを入手する予定であったが、共同研究者のSwanson教授が既に同マウスを作製、スプライシング異常を解析済みであるということが判明したため、共同でその解析にあたった。そのため、MBNL1/MBNL2のノックアウトマウスのスプライシング異常プロファイルの作製は当初の予定より速やかに達成された。またヒトDM1患者剖検脳を使い、両ノックアウトマウス脳で見られたスプライシング異常がヒトDM1患者脳でも認められることが分かった。脳ではMBNL1/MBNL2二つのスプライシング制御蛋白が関与していることが我々の研究から証明された。MBNL2ノックアウトマウスの解析では、本症で見られる認知機能障害、睡眠障害が再現され、認知機能障害についてはNMDA受容体の機能低下の関与が示唆された。「脳各部位でMBNL1/2蓄積などの各種パラメーターの検討」については、マウス、ヒトでのMBNL1の発現量、スプライシング異常、CTGリピート数（DM１患者における）について検討することができた。「スプライシング異常の培養細胞での再現、治療可能性の検討」については、神経細胞に分化する培養細胞（P19細胞）を用いて、分化に伴うスプライシング変化を再現し、CUGリピートの延長したRNAを発現させることによって、スプライシング変化を阻害する細胞モデルを作成できた。しかし、MBNL強制発現による治療効果を確認できなかった。

Strategy for Future Research Activity

本症では1.DNA上のDMPK遺伝子におけるCTGリピートの延長→2.RNA上のCUGリピートの延長が核内に蓄積→3.スプライシング制御蛋白の核外への搬出障害→4.スプライシング異常→5.脳の各部位での機能障害が起こっていると考えられる。今後は以下のような実験を計画している「1.脳各部位でのCUGリピート延長RNAの蓄積の程度の検討」として、大脳-小脳間でDMPK遺伝子の転写量、CUGリピート延長RNAの蓄積の程度がどのようになっているかを検証する。「2.脳各部位でのスプライシング制御蛋白の核内蓄積の有無」として、上記1.と関連してどのスプライシング制御蛋白が、通常脳のどの部分に存在しているか、各部位での細胞内局在はどのようであるか、DM1患者ではどのように細胞内局在が変化しているかを解析する。「3.脳各部位でのスプライシング異常の程度」としては、平成23年度に側頭葉と小脳については調べているが、より多くの部位でのスプライシング異常の違いを明らかにする。「4.スプライシング異常による機能障害の検討」として、我々は、研究実績の概要で述べたように、脳で多くのスプライシング異常を見出したが、それによる機能障害の解析はこれからの課題である。今後本症で見られる睡眠障害につながる機能障害候補遺伝子のスプライシング異常の機能的な差異を検討していく。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

消耗品の購入、研究支援者への謝金などに使用する。消耗品では、免疫染色、FISHを行うための抗体やFISH用試薬も必要となる。

Research Products

• [Journal Article] Muscleblind-Like 1 Knockout Mice Reveal Novel Splicing Defects in the Myotonic Dystrophy Brain (2012)
  • Author(s): Koichi Suenaga, Kuang-Yung Lee, Masayuki Nakamori, Yoshiki Tatsumi, Masanori P. Takahashi, Harutoshi Fujimura, Kenji Jinnai, Hiroo Yoshikawa, Hongqing Du, Takashi Kimura, et al.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 7 Pages: e-33218
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0033218
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 筋強直性ジストロフィー症におけるスプライシング異常およびその分子機序の解明 (2011)
  • Author(s): 末永浩一，木村卓，Lee K，中森雅之，高橋正紀，松村剛，藤村晴俊，陣内研二，久保秀司，玉置（橋本）知子，Ares M, Swanson MS, 芳川浩男
  • Organizer: 第52回日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2011．5.19
• [Presentation] 筋強直性ジストロフィー心筋におけるNaチャネルのスプライシング異常. (2011)
  • Author(s): 穀内洋介, 中森雅之, 木村卓, 松村剛, 藤村晴俊, 佐古田三郎, 高橋正紀
  • Organizer: 第52回日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2011．5.19
• [Presentation] Muscleblind-like 1 Knockout Mice Reveal Novel Splicing Defects in the Myotonic Dystrophy Brain. (2011)
  • Author(s): Kimura T, Lee K-Y, Suenaga K, Nakamori M, Tatsumi Y, Takahashi MP, Fujimura H, Jinnai K, Yoshikawa H, Du H, Ares M, Jr., Swanson MS.
  • Organizer: 8th international myotonic dystrophy consortium meeting (IDMC-8)
  • Place of Presentation: 米国、クリアウォーター
  • Year and Date: 2011.12.2
• [Presentation] Muscleblind-like 2 knockout mice: a model for splicing alterations and neurological changes in the DM brain. (2011)
  • Author(s): Charizanis K, Lee K-Y, Scotti MM, Xia G, Shiue L, Cline MS, Ares M, Jr., Kimura T, Takahashi MP, Fujimura H, Jinnai K, Yoshikawa H, Swanson MS.
  • Organizer: 8th international myotonic dystrophy consortium meeting (IDMC-8)
  • Place of Presentation: 米国、クリアウォーター
  • Year and Date: 2011.12.1
• [Presentation] Altered splicing of cardiac sodium channel in heart muscles of myotonic dystrophy type 1 (2011)
  • Author(s): Kokunai Y, Kino Y, Moyi L, Itoh H, Nakamori M, Kimura T, Matsumura T, Fujimura H, Nukina N, Sakoda S, Horie M, Imoto K, Ishiura S, Swanson MS, Takahashi MP.
  • Organizer: 8th international myotonic dystrophy consortium meeting (IDMC-8)
  • Place of Presentation: 米国、クリアウォーター
  • Year and Date: 2011.12.1