2011 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
23591260
|
|---|
| Research Institution | Kawasaki Medical School |
|---|
Principal Investigator |
村上 龍文 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (30330591)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
砂田 芳秀 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00240713)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
|
| Keywords | 糖尿病性多発神経炎 / 神経再生治療 |
|---|
| Research Abstract |
mouse heart cDNA libraryより、PCRでmouse VEGF-Flagとmouse PlGF2-Flag cDNAを得て、pCAGGSベクターに組み込み、塩基配列をダイレクトシークエンス法で確認した。 この２種類のプラスミドを各々正常マウス前脛骨筋に筋注し(50μl, 1μg/μl)、エレクトロポレーションを施行し遺伝子を導入した。１週間後に筋を抽出し、パラフィン包埋し、切片を作成、HE染色にて観察したところ、新生血管の増生と単核球の浸潤が認められVEGFやPlGF2が発現していることが示唆された。 次にmouse VEGF-Flagプラスミドを正常マウス前脛骨筋に遺伝子導入したあと１週間後にL4, L5, L6（マウスはL6まである）各々の後根神経節(DRG)DNAのプラスミドの有無をPCRで調べたが検出限界以下であった。従ってpCAGGSベクターそのものが逆向性軸索輸送で運ばれたのでないと思われる。 次にDRG由来の蛋白でWestern blot法を行いVEGF-FlagのDRGでの存在を証明しようとしたが、どのマウスDRGも1mg以下で十分な蛋白を得るのが技術的に難しいことが判明した。 一方糖尿病マウスの感覚ニューロパチーを、尾神経感覚神経伝導検査と坐骨神経を電子顕微鏡で病理学的に検討し、ストレプトゾトシン(STZ)投与１週後より感覚神経伝導速度は減少し、投与９週後には無髄線維の萎縮が生じていることを見いだした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
VEGFの逆向性軸索輸送機序の解析については、発現ベクターを構築し、筋内で発現させることができ、PCR解析で発現ベクターそのものが輸送されるのではないことまで証明できたが、マウスDRGが十数個集めても数mgと微量なことからウエスタンブロット解析が困難なことが明らかとなり、VEGFそのものの逆向性軸索輸送の証明にはいたっていない。そこでまず正常坐骨神経で結紮により逆向性輸送蛋白を蓄積させて、免疫染色とELISA法でVEGF-Flagとmouse PlGF2-Flagで逆向性軸索輸送を証明することとしている。 VEGFの神経再生機序の解明については、このddY糖尿病マウスが電気生理学的、病理学的に高血糖でまずどのような状態になっているかを経時的に検討した。その結果いままでマウスでは証明されていなかったがSTZ投与１週後より感覚神経伝導速度は減少している事や、９週後に無髄線維が選択的に萎縮していることを見いだした（論文準備中）。現在この糖尿病マウスでVEGFシグナル系が坐骨神経のmRNAレベルでどう変化しているかの検討を予定している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
VEGFの逆向性軸索輸送機序の解析についてはマウス末梢神経系の小ささを考慮し、まずは正常坐骨神経で結紮により逆向性輸送蛋白を蓄積させて、免疫染色とELISA法の２種類の方法でVEGFの逆向性軸索輸送を証明する。またVEGF-Flag発現筋と神経終末の関係を確認するためpIRES2-ZsGreen1 vectorにVEGF-Flag cDNAを組み込み、電気穿孔法で前脛骨へ遺伝子導入しVEGF-FlagとZsGreen1を同時に発現させ、発現筋とVEGF-Flagが取り込まれる末梢神経終末の関係を蛍光顕微鏡で可視可する。最終的には前脛骨筋と対応するL4とL5のDRGで逆向性軸索輸送を免疫染色で確認する。 VEGFの神経再生機序の解明については、糖尿マウスで無髄神経が選択的に障害されているのを解明しているので、その際VEGFシグナル系が坐骨神経のmRNAレベルでどう変化しているかを、VEGFシグナル系の84遺伝子でリアルタイムRT-PCRアレーでまず調べる。つぎにVEGFで治療した時にそれらの遺伝子発現が正常化するかを確認する。再生に関与しているVEGFシグナル系が明らかになれば、坐骨神経のWestern blot法と免疫染色でVEGFシグナル系の蛋白レベルでの動態を明らかにする。またDRGの免疫染色でも同じ変化が生じているかを確認する。同様にNP１受容体に主に働くPlGF2の治療でこの系がmRNAと蛋白レベルで改善するかを確認する。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
前年度未使用研究費は24年度請求の研究費と合わせ新たに必要となった新規発現ベクター構築のためのpIRES2-ZsGreen1 plasmidの購入や、VEGFシグナル系発現を調べるリアルタイムRT-PCRアレー６プレートの購入にあて神経再生に関与するシグナル伝達系を集中的に調べる。さらに本プロジェック成果の一部を米国フィラデルフィアでの遺伝子細胞治療学会、日本神経学会総会、日本神経科学会で発表し、神経再生の情報収集するための旅費として使用する。その他の経費としては現在投稿を準備している論文の掲載費ならびにリプリント代に使用する予定である。またマウスの飼育や糖尿病モデル作成などマウスでの動物実験の研究を円滑に遂行するため研究補助者の謝金として使用する。
|
