2011 Fiscal Year Research-status Report
ＭｇｃＲａｃＧＡＰの分解機構：新しい細胞周期チェックポイント
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23591370
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
沖 俊彦 東京大学, 医科学研究所, 特任助教 (30549481)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 俊雄 東京大学, 医科学研究所, 教授 (20282527)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| Keywords | ユビキチンープロテアソーム系 / 細胞周期 / 血液内科学 |
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| Research Abstract |
我々は細胞周期制御蛋白であるMgcRacGAPの新しい制御機構の一つとして、ユビキチン依存的な分解機構を提唱し、そのユビキチン化の検証及びメカニズムの解析を行った。 まずＨＡタグ化ユビキチンのコンストラクトを作成、これをMgcRaGAPとともに293T細胞に大量発現しMgcRacGAPのユビキチン化されることを確認した。次に、このユビキチン化を担うユビキチンリガーゼの同定を行った、既知の細胞周期依存的なユビキチンリガーゼの基質認識サブユニットであるCdh1,Cdc22, Skp2, FBW7,beta-TrCpのコンストラクトを用い、MgcRacGAPとの大量発現体（293T細胞）を作成したところ、MgcRacGAPがCdh1特異的に分解をされることを同定した。また併せてプロテオーム解析を行い、新たなユビキチンリガーゼ候補を同定した。詳細は現在解析中である。また分解調節領域を同定する為に、MgcRacGAPのＮ末、Int, cys, GAP, C末各種欠失変異体を作成した。これらそれぞれとCdh1との大量発現体（293Ｔ細胞）を作成したところ、MgcRacGAPのＣ末（537-632）分解調節領域であることを同定した。さらにMgcRacGAPのｍＲＮＡ量の調節機構として、転写及びmicroRNAによる調節機構構も解析、miR-19aによる調節機構を同定した。詳細は現在検討中である。 MgcRacGAPの量的制御は細胞分裂を円滑に行う上で不可欠であると同時に、その異常は発がんのメカニズムと関係しうる。本研究ではこれまで解明されていなかったMgcRacGAPの量的制御機構をmRNAレベル、蛋白レベルで解明するとともに、その生理的意義特に腫瘍形成との関連性に重点を置きながら施行することが重要な点である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究目標の中で最大のポイントであるMgcRacGAPのユビキチン化による制御機構の詳細特にユビキチンリガーゼの同定と分解制御領域の同定を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
shRNAや各種遺伝子変異マウスを利用し、ユビキチンリガーゼの検証を行う。併せてMgcRacGAP遺伝子欠損ＤＴ40細胞株Time-lapse imagingを用い、MgcRacGAPの分解機構の可視化とその生理的意義について解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
MgcRacGAP変異体、Rho活性化プローブ、各種microRNA等のプラスミド作成及び大量発現体の作製、維持培養を行うとともに、各種抗体・低分子化合物などの試薬を用い、MgcRacGAPの発現調節機構の解析及びMgcRacGAP等の大量発現体の解析を行う。
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