大腸癌におけるケモカイン・ケモカインレセプターの発現とメカニズムの検討

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23591957
• Research Institution: University of Fukui
• Principal Investigator: 山口 明夫 福井大学, 医学部附属病院, 教授 (10174608)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 五井 孝憲 福井大学, 医学部附属病院, 講師 (60225638)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: 大腸癌 / ケモカイン / ケモカインレセプター

Research Abstract

大腸癌において転移(巣)への対策が、生存率の向上に重要と考えられる。近年ケモカイン・ケモカインレセプターの発現が癌細胞の浸潤、転移に重要な役割を示すことが推測されており、今回検討を行なっている。当科独自の手法による抗体の作製は、ケモカインレセプター: CXCR4遺伝子ならびにCXCR4に結合するケモカイン:CXCL12遺伝子のPCR 産物を蛋白発現ベクター pGEX に挿入後、コンピーテント細胞にトランスフォーム、融合蛋白を精製終了した。次いで精製蛋白をマウスに3回免疫後、脾臓細胞とNS-1細胞をfusionして、Limiting dilution法によるサブクローニングを行ない、各抗原に対する反応も確認している。なお予備実験段階ではあるが、高CXCR4 mRNA 発現型大腸癌細胞株に対して、作製した抗体を用いた免疫組織化学染色にて発現も確認している。またヒト細胞内発現型CXCR4遺伝子ならびにCCR7 遺伝子ベクターの作製は、ヒトcDNA ライブラリーからcoding region の全長が含まれるようにプライーマーを設定してCXCR4、CCR7 cDNAのクローニングを終了している。現在は細胞内蛋白発現ベクターに組み換え後、細胞株に導入して細胞内での発現を確認中である。抗体ならびにベクターの作製は最終段階に入っており、確認後、計画を続行していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

抗体ならびにベクターの作製は最終段階に入っており、確認後、計画を続行していく予定である。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、ほぼ順調に実験は遂行しており、24年度も以下の計画予定に沿って行う予定。(1)低CXCR4、CCR7遺伝子発現型の大腸癌細胞株に当科において作製したCXCR4遺伝子ベクターならびにCCR7 遺伝子ベクターを導入し、誘導物質としてケモカイン:CXCL12、CCL19蛋白質を用いてトランスウエルチャンバーにて細胞運動能、浸潤能を測定し、低CXCR4、CCR7遺伝子発現型大腸癌細胞株との変化について検討する。（研究代表者：山口）(2)高CXCR4またはCCR7遺伝子発現型大腸癌細胞株に当科オリジナルで作製したSi-RNA(CXCR4、CCR7)を導入後、Invasion assay、Migration assayにて浸潤能、遊走能の変化について検討する。（研究分担者：五井）

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

本年度は、実験も順調に遂行し計画通りに使用できた。24年度も組織染色用試薬一式、抗体作製用試薬一式、抗体精製などに使用する予定で、本年度の若干の残額も加えこれらの消耗品費に充てる。