2011 Fiscal Year Research-status Report

急性肺損傷発症機序の解明と、治療戦略の確立にむけた多角的アプローチ

Research Project

Project/Area Number	23592303
Research Institution	Yokohama City University
Principal Investigator	倉橋清泰横浜市立大学, 市民総合医療センター, 准教授 (50234539)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	矢澤卓也杏林大学, 医学部, 准教授 (50251054) 馬場靖子横浜市立大学, 市民総合医療センター, 講師 (80453041)
Project Period (FY)	2011-04-28 – 2014-03-31
Keywords	KGF / Fas / エンドトキシン / アポトーシス / サイトカイン / ARDS / 肺上皮細胞
Research Abstract	肺胞上皮細胞のcell lineとしてMLE15 を選び、そのモノレイヤーにFasのリガンドであるhFasLおよびLPS (E. coli O111:B4)を暴露させた。hFasLのdoseとしては0～500 ng/ml、一方LPSは予備実験で本細胞株がLPSに対する感受性が非常に高いことがわかったため、0～40 pg/mlの間で振った。FasL、LPSを暴露する時間は４時間及び１６時間とした。アポトーシスの定量には、caspase-3/7の活性化の定量を行った。caspase-3/7の活性は、16時間後の定量では、FasLもLPSも有意な影響を持たなかった。FasLの４時間の暴露によってcaspase-3/7活性は用量依存性に上昇した。LPSは単独では活性に影響しなかった。ところが、FasLの存在下では、LPSがその活性を用量依存性に低下させることがわかった。培養上清のTNF-alpha、IL-6、IL-1beta、KC及びMIP-2を定量した(ELISA)。TNF-alphaとIL-1betaはいかなる条件でも分泌されなかった。IL-6、KC及びMIP-2はLPSにより用量依存性に分泌増加した（4時間＜16時間）。これらのサイトカインは、FasLにより若干増加する傾向があったが、有意な影響ではなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の条件設定に多少てこずったため進行が若干遅れた。今年度計画していた、MAPKのリン酸化の定量が年度中にできなかった。
Strategy for Future Research Activity	FasLおよびLPS刺激下のMLE12における細胞内MAPKのリン酸化、およびNF-kBの動向を探る。さらに、Fasの細胞内ドメインの共役物質であるFADDやMyd88の動向にも注目する。次いでin vivo実験にうつる。 BALB/cをケタミンとキシラジンで麻酔後に仰臥位で傾斜をつけた台に固定し、声門を直視下にFasL and/or LPSを注入する(control群も含めて組合せで4群)。一定時間経過後、深麻酔下に血液を採取し、一方の肺で肺胞洗浄(BAL)、他方で組織採取を行う。BAL回収液は、細胞数（比）計測後、-80℃で冷凍保存し、後の測定に供す。取り出した肺は、組織解析用にフォルマリン固定し、一部はRNA採取用に急速凍結する。さらに別の一群では、ラジオアイソトープでラベルしたアルブミンを同時に肺に注入し、血液中のアイソトープカウントから、肺の障害の程度を定量する。次いで遺伝子操作の群を検査する。KGFのhyper-expressionでは、従来用いているアデノウイルスベクター作成法を用いる。ただし、今回プロモーターをCAGから in vivoの系ではCAGプロモーターよりも優れていると考えられるelongation factor 1αに変更する。一方、knock downの系はhydrodynamic法 (Silencer In Vivo Ready siRNA, Ambion) を用いて全身へsiRNAを導入する。これらの遺伝子操作の効果を検討する。Read out は前項に準ずる。KGFのknock downが計画通りにいかない場合は、KGF (FGF-7) knock outマウスを用いた研究に変更することも考慮する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	上で述べた実験を継続するために、試薬、動物、飼育料、アッセイキット等の消耗品に当てる。実験の遂行のために、本年度雇用した研究補助員の弓場には引き続き勤務してもらうため、謝金を計上する。また、consultantとの打合せや成果発表のための国内、国外旅費を計上する。