2011 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子ノックダウン手法を用いた血小板細胞死がもたらす敗血症増悪病態の解明
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23592307
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
中嶋 康文 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70326239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴崎 雅志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20405319)
溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50239266)
橋本 悟 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90167578)
佐和 貞治 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10206013)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | RNA干渉法 / 敗血症 / 血小板 |
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| Research Abstract |
患者予後と関連する重症敗血症時の炎症増悪の原因として、我々は過度の血小板活性化とその後引き続き起こる血小板細胞死の現象が関与していると考えている。その機序と新しい予防法・治療法を見出すために、分子生物学的手法を用いた遺伝子ノックダウン血小板細胞と生理活性 (細胞透過性ペプチドを含む) 物質を用いた治療法の開発に焦点を当てて研究展開したいと考えた。本年度の研究計画としては、ヒト遺伝子ノックダウン血小板細胞において、以下の反応を見た。1.血小板凝集反応（透過法） 2.血小板Ca放出反応（Fluoro-3, フローサイト法）。3.血小板内キナーゼリン酸化解析 ERK,AKT,p38,JNKのリン酸化/Total(比)変化の定量 （フローサイト法）。 4.血小板ミトコンドリア膜電位変化の定量（JC-1染色、フローサイト法） 5. 血小板ミトコンドリアチトクロームC含量の変化（ウェスタン、フローサイト法） 6.血小板膜表面へのホスファチジルセリンの発現の変化Annexin V＋(フローサイト法) 7.血小板内Bcl-2ファミリータンパク質の発現の変化Bcl-xl, Bcl-2, Bax, Bak, Bim発現の変化（フローサイト法） 8.血小板内カスパーゼ発現の変化 Caspase 3, 9（フローサイト法） LPSまたはHMGB1添加をすることで生理食塩水添加群に比べ、経時的な血小板活性化と細胞死過程が進行し、血小板細胞内p38MAPK のリン酸化とBax上昇を見た。 またBax又はp38α遺伝子のノックダウン血小板細胞においては、コントロール群(Negative Control miRNAを導入した遺伝子正常血小板細胞)に比べ、血小板活性化と細胞死変化が軽減することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子ノックダウン血小板細胞作成に時間を費やし、一部の遺伝子ノックダウン血小板細胞作成について作成途上中にある。 また、In Vitro系において、血小板細胞内のmicroRNAの発現に新しい知見を得た。具体的には、実験経過において、ヒト血小板細胞内のmicro RNA発現の違いが、LPSの反応の違いに関与していることが分かった。 従って、当初本年度に予定していた生理活性物質 Resolvin D1, D2, Maresin1(Cayman社)の前投与により、LPS又はHMGB1に対する上記測定項目の細胞死変化の抑制度を調べる実験について、開始するに至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
miR-1, miR-122の発現とLPS刺激による血小板内Baxの発現、及び血小板表面抗原Glycoprotein Ibの発現低下の相関関係がある可能性を見出した。つまり、miR-1, miR-122の発現が上昇している披験者ほど、血小板内Baxの発現が抑制されていることで、血小板が細胞死になりにくい可能性が示唆された。今年度の実験予定として、血小板内のmiRNA発現と、血小板内Bax, Bak発現上昇及び血小板表面Glycoprotein Ib発現低下との関連を、分子生物学的手法により、細胞内情報伝達系解明することを実験計画予定にしている。（In Vitro系） はじめに、High Responder(高反応者)とLow Responder(低反応者)のリストを作成し、LPSに対しBaxが発現しやすい高反応者群と発現しにくい低反応者群（各N=20）の血小板濃厚血漿溶液を作成後、CD45陽性ネガティブセレクションにより白血球除去を行いmicroRNAとタンパク質を精製する。miR-1, miR-122の発現とそれに対応して抑制するとされるmRNA、蛋白質の発現を複数のmiRNA Prediction Tool (Miranda, TargetScan Human5.0, PicTar, miRBase Targets Version 5.0)等のデータベースにより、Baxに対応するmiRNA候補を探索する。候補のmicroRNA のMimic (Positive Control) と、Inhibitor を血小板系培養細胞(Meg-01細胞）に遺伝子導入することで、実際Baxを制御するmicroRNAで有ることを確認する。 その後、高反応者群と低反応者群のヒト血小板細胞において、平成24年度において行った血小板細胞内情報伝達系について違いを観察する予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
miRNA関連品、Nulcleofection法（新しい電気穿孔法による遺伝子導入法）を用いた関連試薬、PCR関連品、インヒビター、抗体、ペプチド、ELISAキット、培養関連品等を使用予定である。 フローサイトメトリー用の抗体は、固定標本に比べ染色時に高濃度の抗体を要する為、使用量が多くなると考える。miRNA関連品、Nuleofectionキット、ペプチド、ELISAキットについては、１バイアル、１キット当たり５万円から２０万円程度であり、１回の実験で２万円から５万円程度のコストを要する時もあるため、研究費は主に消耗品費用として使用する予定である。
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