2012 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子ノックダウン手法を用いた血小板細胞死がもたらす敗血症増悪病態の解明
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23592307
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
中嶋 康文 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70326239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴崎 雅志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20405319)
溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50239266)
橋本 悟 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90167578)
佐和 貞治 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10206013)
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| Keywords | 敗血症 / 遺伝子治療 |
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| Research Abstract |
（目的）敗血症病態においては血小板が病原微生物由来のPAMPsを認識し、好中球に結合して血小板好中球複合体を形成し，活性化血小板との相互作用により好中球がetosisを起こし、自らを犠牲にしてNETsと呼ばれる粘着性の網を放出し，効率的に病原体を捕捉・殺菌する。しかし、この現象が極度に起これば好中球より産出されるその他の物質により臓器障害を来す可能性がある。また以前より敗血症の病態において血小板減少が患者予後不良因子として深く関与していることが広く知られているが、活性化血小板と引き続き起こる血小板細胞死の際にホスファチジルセリンが露出する血小板膜表面上でトロンビンが大量に生成されることや、血小板数低下により抗菌能や炎症消退物質産生を低下させることが炎症増悪の要因になると我々は考えている。
前年度に作成したヒト遺伝子ノックダウン血小板様細胞をBax, Bcl-XlをターゲットにしたsiRNAを用いて作成した。培養細胞を用いた場合、血小板の産生に１週間程度しか要しないため、ウィルスベクターが不要で簡便なのでMeg01細胞を使用した。
（結果）健常成人より採取した活性化血小板をトロンビンでと好中球を共培養するとNETsが形成されることを細胞免疫蛍光染色法で確認した。
活性化Bax遺伝子ノックダウン血小板様細胞を好中球と共培養すると、コントロール遺伝子ノックダウン血小板遺伝子様細胞に比べ、NETsの形成が促進した。一方でBcl-Xl遺伝子ノックダウン血小板遺伝子様細胞の場合は、NETsの形成が抑制された。
また、Resolvin（ω-3脂肪酸のエイコサペンタエン酸 (EPA)由来のEシリーズとドコサヘキサエン酸(DHA)由来のDシリーズに大別される）、Maresin（DHA由来）等は、抗炎症性脂質メディエーターファミリーを前投与することにより、NETsの形成が抑制された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度から、ラットまたはマウスを用いた動物実験を施行予定にしていたが、培養細胞実験系において細胞免疫蛍光染色法によるNETsの観察方法の確立に時間がかかり、開始できていない。来年度において施行予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ラットまたはマウスを用いたにLPSを投与することにより敗血症モデルを作成し、経時的な末梢血における血小板及び好中球の活性化及び細胞死の変化を観察する。また、血管内のNETs生成の定量化を免疫組織染色法によって行う。
また、細胞内情報伝達系の詳細も観察するため遺伝子ノックダウン細胞を用いたIn Vitro実験も継続して行う予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究に用いられる試薬（抗体、ペプチド、PCR関連品、インヒビター、ELISAキット、Nulcleofection法を用いた関連試薬、miRNA発現ベクター、培養関連品等）は大変高価である。 フローサイトメトリー用の抗体は、固定標本に比べ染色時に高濃度の抗体を要する為、使用量が多くなる。また、ELISAキット、Nuleofection キット、miRNA発現ベクターキットについては、１キット当たり５万円から２０万円程度であり、１回の実験で２万円から５万円程度のコストを要する時もある。よって主に消耗品に使用予定である。
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