2011 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子導入技術を用いた精子形成遺伝子の同定とその細胞内シグナル伝達分子の機能解析
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23592382
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
梅本 幸裕 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80381812)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
郡 健二郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30122047)
佐々木 昌一 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50225869)
窪田 裕樹 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10347403)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70448710)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | Numb / Numb-like / 造精機能障害 / 男性不妊症モデルマウス / 停留精巣 / siRNA |
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| Research Abstract |
１．ラット精巣におけるNumb/Numb-likeの局在の確認： 正常ラット精巣におけるNumb/Numb-likeタンパクの局在を免疫組織化学により検討した。精子形成が認められる6週前後から精子形成が活発に行われている12週にかけて経時的に検討した。さらに造精機能障害モデルラット精巣についてもNumb/Numb-likeの発現局在を検討した。２．男性不妊症モデルマウス（以下モデルマウス）の準備： 先天異常モデルラットとして、フルタミド（抗アンドロゲン剤）を胎児（母体内）投与することにより、停留精巣モデルを作製した。停留精巣モデルマウスは非ステロイド性抗アンドロゲン剤であるflutamideを、妊娠マウスに15 mg/日・腹腔内投与し、生まれてきた仔を停留精巣モデルマウスとして用いた。３．In vivo導入のためのNumb/Numb-like siRNA発現ベクターの構築： NumbおよびNumb-likeに対するsiRNA配列の作成を行った。得られた配列より、相補的なオリゴヌクレオチドペアを作成し、これをpcDNA TM6.2-GW/EmGFP-miRにインサートすることにより、NumbおよびNumb-likeのsiRNA発現ベクターを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定した経過通り、まずはラット精巣におけるNumb/Numb-likeの局在の確認できた。これにて精巣内でのNumb/Numb-likeの造精機能関与における手がかりとなることが期待できる。また造精機能障害モデルラットが作成できたことで、健常の精巣と機能障害を認める精巣との違いが検討できる。またsiRNAベクターが作成できたため、直接Numb/Numb-likeをノックダウンできることが期待できる。これにより正常精巣とノックダウンした精巣、造精機能障害を認める精巣での造精機能の違いを今後詳細に検討できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Numb/Numb-likeのノックダウン実験：平成23年度で構築したNumbおよびNumb-likeに対するsiRNA発現ベクターを用いてin vivoでのNumb/Numb-likeのノックダウン実験を行う。ラットは4週齢雄Sprague-Dawleyラットを用い、以下の４群を作成。Group A: Numb siRNA発現ベクター導入群、Group B: Numb-like siRNA発現ベクター導入群、Group C: Numb siRNA発現ベクターとNumb-like発現ベクターを両方導入群、Group D: ネガティブコントロール siRNA発現ベクター導入群 の4群に分ける。ベクターを左精巣網より30ゲージ針を用いて注入、その後、精巣にエレクトロポレーション法にて遺伝子導入を行う。右精巣はコントロールとして用いる。導入後１，２，４，８，週後に精巣を摘出し以下の検討を行う。(1)ベクター導入効率・発現期間の検討、(2)精巣におけるNumb/Numb-like遺伝子機能の検討
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
今後も、多くの実験動物を使用していく。またsiRNA発現ベクターを用いてin vivoでのNumb/Numb-likeのノックダウン実験を行う。これには遺伝子導入法としてエレクトロポレーション法を使用予定である。多くに遺伝子発現を見るためのPCR法も多用する必要がある。また発現の有無の確認での免疫染色を行う予定である。
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