2011 Fiscal Year Research-status Report
アルコールはセルトリ細胞のオートファジーを増加させる
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23592386
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大槻 勝紀 大阪医科大学, 医学部, 教授 (50140166)
伊藤 裕子 大阪医科大学, 医学部, 講師 (40148432)
神原 清人 大阪医科大学, 医学部, 講師 (40298758)
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| Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| Keywords | アポトーシス / オートファジー / アルコール障害 / ミトファジー / 精巣 / セルトリ細胞 / 精細胞 |
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| Research Abstract |
慢性アルコール中毒により精細胞はデスレセプターパスウェイによりアポトーシスで死ぬが、セルトリ細胞は空胞化を起こすのみで死ぬことはない。慢性アルコール中毒のセルトリ細胞はオートファジーを活性化することにより、生存しているのではないかと仮説をたて、実験を行った。Wistarラットに５％のエチルアルコールを加えたLiever-DeCarli liquid dietを１２週間与えたのち、精巣を摘出しパラフィン包埋試料と透過型電子顕微鏡用試料を作製した。TUNEL法でアポトーシスを検討すると、精細胞にはアポトーシスが観察されたがセルトリ細胞では認められなかった。電顕観察で慢性アルコール中毒のセルトリ細胞の細胞質にはオートファジックバキュオールが多数観察された。また、オートファジックバキュオールの内容物の多くは変性したミトコンドリアであり、ミトファジーが起こっていると考えられた。オートファジーのマーカーであるLC3、オートファゴソームのマーカーLAMP2で免疫染色すると、慢性アルコール中毒のセルトリ細胞の細胞質に点状に多数のオートファジックバキュオールが観察された。電顕レベルの免疫染色でミトコンドリアを隔離したオートファゴソームにLC3が認められた。以上から、セルトリ細胞はアルコールによりダメージを受けたミトコンドリアをオートファジーで処理することで生存していることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
セルトリ細胞はアルコール障害を受けたミトコンドリアをオートファジーで排除することで、生存していることが確認でき、論文を発表している。
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| Strategy for Future Research Activity |
42GPA9マウスのセルトリ細胞株を10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin含有のEagle mediumで5%CO2インキュベーターにて培養する。アルコールの直接的影響を検討するために3% FBS含有のダルベッコ緩衝液でエタノールを2.5, 5, 10, 25mMに希釈した溶液でそれぞれ24, 48, 72時間培養する。生存率はCell-Titer Blue Cell Viability Assay Kit (Promega)を用いて行う。Beclin-1, LC-3, LAMP-2でオートファジーの検索を、酸化ストレスマーカー8-OHdG, HNE、脂肪の同定はOil Red O染色で行う。オートファジー阻害実験：クルクミン、マンゴスチンの至適濃度はCell Viability Assayで決定する。エタノール添加培養によりオートファジーを誘導し、至適濃度のクルクミン、マンゴスチンを添加、オートファジー阻害効果の評価はBeclin-1, LC-3, LAMP-2抗体を用いたWestern blotで行う。Caspase活性測定によりオートファジーのシグナル伝達経路が推測された場合には、そのCaspase阻害剤を添加して確認する。急性アルコール障害ラットモデルを作製する。クルクミン、マンゴスチンをそれぞれ80mg/Kg ~160mg/Kgまでの濃度を振り分けて経口投与する。投与期間は経時的に８週までとする。治療効果およびオートファジーの評価はH.E染色、Beclin-1, LC-3, LAMP-2の組織学的、生化学的検索による。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
セルトリ細胞の培養に関わる試薬、オートファジーのマーカー抗体（Beclin-1, LC-3, LAMP-2）、細胞生存率検定キット（Cell-Titer Blue Cell Viability Assay Kit ）、caspase活性測定キット、Western blotの試薬、クルクミン、マンゴスチンの購入に使用する。
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