手術摘出卵巣からの卵子を用いたヒト加齢に伴う卵子減数紡錘体機能の変化に関する研究

2011 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23592392
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 熊谷 仁 秋田大学, 医学部, 講師 (60333936)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤本 俊郎 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20375249) ; 寺田 幸弘 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10260431)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2014-03-31
• Keywords: 減数紡錘体 / 加齢 / 中心体タンパク / ポロスコープ / 卵巣卵子採取

Research Abstract

1：子宮体がん手術し摘出卵巣からの卵子の採取を行うため、秋田大学附属病院倫理委員会に研究課題を提出し、審議いただいた。今後、この説明書・同意書を用いてインフォームドコンセントを行い、未熟卵を採取し実験に供する。2：平成23年度にヒト卵子採取後の体外成熟培養を予定していた。ヒト卵子を用いる本実験のまえに、マウス卵を用いた体外成熟培養を仮実験として行い技術習得を行った。極めてサンプリングが困難なヒト検体による本実験前に培養環境、設備の充分な準備を行った。3：平成24年度以降に予定している未成熟卵に対するmRNA顕微注入の準備を行った。顕微授精は当病院の臨床現場では確立された技術ではあるが、実験室での顕微授精技術取得のため、マウス卵を用いた仮実験を試行し、技術修練を行った。4：平成24年度以降に予定しているライブイメージングによる卵子成熟の観察に用いるためのタイムラプス蛍光顕微鏡を当研究室に導入し、その培養環境、観察設定を確立した。5：未だ培養法が確立されていないヒト卵子の体外培養法を検討するため、日本生殖医学会、哺乳動物卵子学会等の参加により、情報収集を行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

震災の影響により、当研究室の研究活動が正常化するまで時間を要したこと倫理委員会の承認に時間がかかったことヒト検体による本実験前の仮実験を行ったこと

Strategy for Future Research Activity

平成23年度に予定していた実験にかかる費用は、上記のように震災の影響により、当研究室の研究活動が正常化するまで時間を要したことにより、一部を24年度に繰り越しせざるを得なかった。1：子宮体がん手術し摘出卵巣からの卵子の採取 →　月経周期の存在する子宮体がん手術前患者より、術前に当院倫理委員会で承認された卵巣卵子採取に関する説明と同意の所得を行う。手術時に摘出された卵巣表面の小卵胞内容を穿刺、吸引して未成熟卵子を採取する。2：減数分裂各層の卵子の採取と体外成熟培養　→　得られた未成熟卵子は対外成熟培地に供され、成熟卵子が採取される。一部の卵子は、微小繊維阻害剤であるサイトカラシンＤ添加培地で成熟が誘導された卵子はMetaphase Iの段階で減数分裂が停止する。これらの実験に供する。3：個体年齢による卵子の形体の相違の検討　→　得られた卵子をポロスコープにて観察することによりその減数紡錘体の成体観察が可能である。紡錘体の大きさ（極間距離）、第一極体としての位置関係、紡錘体の卵子内での位置（卵子細胞膜と紡錘体極との距離と角度）などを観察、計測した上で、年齢群別に比較検討する。4：ライブイメージングによる卵子成熟の観察と個体年齢によるその比較　→　採取した未成熟卵子に微小管結合タンパクEB1-GFPあるいは核を標識するH2B-GFPをそれぞれコードするmRNAを顕微注入する。注入2時間後よりタイムラプス蛍光顕微鏡にて卵子を経時的に観察する。得られた画像を解析して、染色体の結合、分離の挙動を観察し、患者年齢との関連を検討する。さらに、紡錘体形成時期とその形態も観察し、年齢との関連を検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

上記研究方針に従い、卵子培養用品、顕微授精用品、免疫染色用品およびRT-PCR用品等、消耗品費として使用する。また、引き続き、ヒト卵子体外培養の情報収集のため生殖関連学会へ参加、発表を行う。