2011 Fiscal Year Research-status Report
オートファージー誘導による内耳保護作用の新規分子標的治療への応用
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23592494
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Research Institution | Keio University |
Principal Investigator |
五島 史行 慶應義塾大学, 医学部, 客員講師 (80286567)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神崎 晶 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (50286556)
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Project Period (FY) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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Keywords | 内耳培養細胞 / オートファジー / 酸化ストレス / Atg7 / p62 |
Research Abstract |
酸化ストレス下では内耳培養細胞HEI-OC1にオートファジーが誘導されるかどうかを確認することを目的として、GFP-LC3をHEI-OC1に遺伝子導入し、共焦点レーザー顕微鏡下にてGFP-LC3の発現を細胞質内に確認した。その際に、核は扁平化、細胞質は膨張し、形態的にはnecrosisを起こしていることを確認した。また、電子顕微鏡下でautophagic vacuolesを認めた。すなわち、酸化ストレス下での内耳培養細胞には、autophagyとnecrosisが同時に誘導されていることを確認した。 オートファジーが酸化ストレス下で内耳細胞生死のいずれに関与するのかを確認することを目的として、オートファジー誘導剤であるラパマイシンを活性酸素処理したHEI-OC1に投与したところ、細胞生存率は活性酸素単独処理時と比較して有意に上昇した。逆に、オートファジー関連遺伝子であるAtg7をsiRNAによってノックダウンし、オートファジー誘導を止めた場合、細胞生存率は有意に著しく低下した。この結果は、オートファジーが酸化ストレス下での内耳細胞生存に非常に重要な役割を果たしていることを示唆している。 Western blot法にて、酸化ストレス処理したHEI-OC1にp62, Nrf2, Keap1の時間依存性の発現増加を確認した。Atg7をsiRNAによりノックダウン(KD)するとp62の発現は低下したが、Nrf2、Keap1の発現は不変であった。酸化ストレス下でのAtg7KD細胞ではp62、Nrf2、Keap1の発現も不変であり、細胞生存率はAtg7正常細胞と比較して有意に低下した。この結果は、酸化ストレス下での内耳細胞にはp62、Nrf2、Keap1の間に直接的な分子クロストークが存在し、この分子クロストークが細胞生存に促進的な役割を果たしていることを示唆している。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
酸化ストレス下での内耳細胞生死:内耳培養細胞を用いた酸化ストレス下でのオートファジーの機能解析は、当初の計画からみると、少しの遅れはあるもののおおむね順調に来ている。当初の予想通り、オートファジー促進剤であるラパマイシンは、内耳培養細胞においてもオートファジーを確実に誘導し、かつ酸化ストレス下でのオートファジー誘導は内耳細胞生存に深く関与することを確認した。また、mTORを介するオートファジーシグナル伝達においてのkey geneの一つであるAtg7のノックダウンによって内耳細胞におけるオートファジーは、機能低下を起こし、酸化ストレス下での細胞死を促進した。これは、in vivoにおいて、内耳有毛細胞でのAtg7機能低下は、難聴を起こす可能性を示唆する結果である。また、Atg7は感音難聴のバイオマーカーになる可能性をも示唆している。逆に、オートファジーの効果的な誘導は内耳細胞保護効果、すなわちin vivoにおける難聴予防効果を示唆している。アポトーシスを中心とする内耳細胞死を防ぐための研究は数多くなされてきたが、オートファジーを焦点とした内耳細胞生存を促進する細胞内因子の研究は皆無であった。一方で、オートファジーは細胞によっては細胞死を誘導する、すなわちautophagic cell deathという概念も存在することから、今回の我々が出した「酸化ストレス下での内耳細胞において、オートファジーは細胞生存に深く関与する」という結果は、全く新しい知見である。今回までの結果で最も重要な点は、酸化ストレス下の内耳細胞において、オートファジーと酸化ストレスセンサーであるNrf2/Keap1シグナル伝達系がp62を介してリンクしていることを確認したことである。
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Strategy for Future Research Activity |
(酸化ストレス下での内耳細胞生死)酸化ストレス下の内耳細胞において内耳細胞死を防ぐことを目的として、p62を介したオートファジーとNrf2/Keap1シグナル伝達系の活性化を効果的に行う方法と薬剤を見つけることを主眼とした研究をすすめる。まず、p62 siRNA, Nrf2 siRNA, Keap1 siRNAを用いHEI-OC1におけるp62, Nrf2, Keap1のをノックダウン(KD)する。これらのKD 細胞での1)p62, Keap1, Nrf2のタンパクレベルでの発現を確認、2)オートファジーとの関連を調べるためタンパクレベルでのLC3、Becrin1、Atg5、Atg7、AMPK、p-AMPK、p-p70S6K、p-AEBP1、PAR、PI3Kの発現と細胞内局在を確認する、3)p62, Keap1, Nrf2のタンパクレベルでの分子間相互作用を免疫沈降などで検討を行う、4)p62, Nrf2, Keap1の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡にて3重染色にて確認し、電子顕微鏡(TEM)下での小胞体、ミトコンドリアをはじめとする細胞小器官の形態変化と細胞質内オートファゴソームの形態を確認する、5)酸化ストレス下での細胞生存率を確認する、6)FACscanにて酸化ストレス下での細胞死の状態(アポトーシス細胞あるいはネクローシス細胞)を確認する。 次に、p62発現ベクターをHEI-OC1に遺伝子導入し、1)Nrf2, Keap1のタンパクレベルでの発現の確認、2)LC3、Becrin1、Atg5、Atg7、AMPK、p-AMPK、p-p70S6K、p-AEBP1、PAR、PI3Kの発現と細胞内局在を確認する、3)Keap1, Nrf2のタンパクレベルでの分子間相互作用を免疫沈降などで検討を行う
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Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
酸化ストレス下の内耳細胞において内耳細胞死を防ぐことを目的として、p62を介したオートファジーとNrf2/Keap1シグナル伝達系の活性化を効果的に行う方法と薬剤を見つけることを主眼とした研究をすすめる。また、細胞内ストレスである小胞体ストレスについても検討する予定である。抗体費(Nrf2:56000円×1本、Keap1:50000円×1本、p62:54000円×2本、Atg7:58000円×2本、Becrin1:52000円、Atg5:58000円、AMPK:50000円、p-AMPK:65000円、p-p70S6K:62000円、p-AEBP1:62000円、PAR:47000円、PI3K:50000円)、薬剤費(ラパマイシン:58000円×4本、3-MA:62000円×4本)、試薬費(p62 siRNA:80000円、Atg7 siRNA:80000円、Keap1 siRNA:80000円、Nrf2 siRNA:80000円、Cell viability Assay kit:70000円×3、Western blot試薬:80000円×3、JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit:94000円を購入する予定である。 さらに、本研究の成果を国内外に示すため、国内、国外への渡航費用として使用する予定である。
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