上皮間葉系移行を標的とした脈絡膜悪性腫瘍の浸潤・転移抑制治療の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 23592583
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 田中 才一 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60316106)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 雑賀 司珠也 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (40254544) ; 岡田 由香 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50264891)
• Project Period (FY): 2011-04-28 – 2016-03-31
• Keywords: 脈絡膜悪性黒色腫 / 線維化 / 上皮間葉系移行

Outline of Annual Research Achievements

ルミカン、オステオポンチン、テネイシンノックアウトおよびワイルドタイプマウスの皮膚下に悪性黒色腫の培養細胞を移植する。皮膚下に作製した腫瘍径を計測し経時的変化を観察する。腫瘍と周辺の組織を摘出し、パラフィン切片を作成し、免疫組織組織学的検討を行う。抗体は、細胞外マトリックス（オステオポンチン、テネイシンC,X、、フィブロネクチン、インテグリンなど）、増殖系シグナルのマーカー（Erk-1及びBrdU）および各種サイトカイン（TGF－β、Smad2,3,4,7、pSmad3C, 3L, 2Cなど）を用いる。血管形成に対する影響は、抗CD31抗体で評価した。その結果、皮膚に現れた腫瘍は平均5mmと増大傾向をしめしていた。また、すべての症例において上皮間葉系移行がおこっていたので、腫瘍の組織に陽性所見を示していた。それと、腫瘍の免疫染色にて上皮細胞と考えられる部位にS100陽性所見を認め、細胞質内にHMB４５陽性所見をみとめており、また抗Melan抗体も陽性所見みとめたために、これらの腫瘍は悪性黒色腫であると同定できた。抗CD31抗体を用いて血管内皮細胞を検出したところ腫瘍組織中の新生血管の著明な減少が見られた。
腫瘍からtotal RNAを抽出し、real-time RT-PCRで各種遺伝子発現について成長因子関連を中心に検討する。発現パターンに変化が検出されたRNAについては、ジゴキシゲニンを使用したin situ ハイブリダイゼイションで組織内の発現パターンを評価する。その結果、Eカドヘリンの発現が抑制していると考えられ、上皮間葉転換を惹起するSnailの発現は抑制、間葉系のマーカーであるslpja-smooth-muscle actinの発現は低下していた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

脈絡膜悪性黒色種での眼球摘出に至る症例数に研究が依存するため、研究の進展が予定を遅れている。摘出眼球のパラフィン切片の収 集を計りたい。研究者らが作成したSmad2/3ミドルリンカーリン酸化に対する抗体が、凍結切片で反応する者の、パラフィン切片で反 応しなかったため、この評価が行えなかった。以降、当該施設での悪性黒色腫の眼球摘出術では、この抗体に限らず腫瘍の悪制度の評 価による予後の検索として凍結切片による免疫組織化学も併用したい。研究申請時の記載のもう一法である皮下移植での評価に主眼を置いている

Strategy for Future Research Activity

複数の摘出人眼の悪性黒色腫、および摘出眼瞼の悪性黒色腫のブロック収集後、パラフィン切片を作成し、免疫組織組織学的検討を行う。抗体は、細胞外マトリックス（オステオポンチン、テネイシンC,X、フィブロネクチン、インテグリンなど）、増殖系シグナルのマーカー（Erk-1及びBrdU）および各種サイトカイン（TGF－β、Smad2,3,4,7、pSmad3C, 3L, 2Cなど）を用いる。
ヒト悪性黒色腫の培養細胞株(RCB0700)を用い、上記の各種細胞外マトリックス挙動と各種シグナルの発現を検討する

Causes of Carryover

研究の過程で前年度分のもので可能であったために次年度に繰り越すこととなった

Expenditure Plan for Carryover Budget

上皮間葉系移行に関する抗体の購入や動物や培養における細胞の購入にしよう予定である