2012 Fiscal Year Research-status Report

アメロジェニンの分布および硬組織形成における役割に対する検討

Research Project

Project/Area Number	23592807
Research Institution	Showa University
Principal Investigator	山田嘉重昭和大学, 歯学部, 講師 (40360127)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	増田宜子昭和大学, 歯学部, 講師 (10297038) 川中岳雄昭和大学, 歯学部, 助教 (10365702)
Keywords	アメロジェニン / in situ PCR / in situ LAMP / in situ hybridizatiom / 胎生マウス
Research Abstract	アメロジェニン遺伝子に対するＰＣＲを昨年度に検討したところ、脳、脈管系、舌、骨組織等に遺伝子陽性反応が確認された。しかし、腎臓、肝臓、肺、生殖器に対する反応は陽性反応に近似した反応が検出されたが、その発現バンドが陽性なのか、擬陽性なのかが明確にできていないため、組織上による遺伝子発現、in situ hybridization法の施行を検討している。これまで、何回かin situPCR法、in situ LAMP法を試みたが、in situ PCR法において、スライドグラスのコーティングを改良して臨んだが、試料切片の破損がどうしても回避できず、破損が生じていない部位においても、遺伝子発現用の陽性反応が染色されているが、切片の縁端によく認められる擬陽性反応であるのかが、確定できず、陽性反応様に観察されても正しい遺伝子発現が得られていない可能性があることは否定できなかった。またin situ LAMP法においても、通常の LAMP法で反応が確認されたプライマーセットでも明確な反応が確認されなかった。そのため、一番反応が確認しやすいin situ hybridization法においてマウス胎児の遺伝子発現を確認することを進めることに計画を変更した。本年度は可能な限りＲＮＡ反応を阻害する要因を与えないように試料作製から遺伝子の分解するリスクが少ないように心掛けてパラフィン切片を作成し、アメロジェニン遺伝子の発現パターンを全身的に観察するという本来の目的の遂行の基礎実験を行っている。また、現在、アメロジェニン遺伝子の新たに報告されたエクソン８、９を含むプローブやプライマーを作成し、遺伝子発現の差異を検討する準備を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初期待していたin situ PCR法とin situ LAMP法による遺伝子発現を組織切片上で確認するという方法に対して可能な限り条件を検討していきながら改良してきたが、明確で再現性の高いプロトコールがなかなかできなかった。そのため当初に予定していた結果を得ることが、なかなかできなかった。しかし、様々な大きさ、領域のプライマーにてＰＣＲ法を繰り返した結果、幾つかの臓器での遺伝子発現は明確なものであるという結果になった。その点もあり、まったく研究が進んでいないとは考えていない。
Strategy for Future Research Activity	次年度は科研費の使用最終年度のため、可能な限り当初の目的であるマウスの全身組織ぞうからアメロジェニン遺伝子発現部位を確認して、どのような部位にアメロジェニンが働いているのかを検討していく。そのため、次年度は一番組織切片にダメージが少なく遺伝子発現を観察できるin situ hybridization法を行うこととする。また、アメロジェニンＲＮＡ遺伝子は可能な限り大きいものとして、遺伝子発現が高く検出できるように行う。in situ hybridization法は組織試料をパラフィンにて行うが、試料作成時や組織切片での操作過程におけるＲＮＡ遺伝子の劣化、発現消失が生じないような試料作成を前年度までの方法に準じて作成していく。またその後、発現が認められた部位に対しては、ノーザンブロット法を併用して、どのくらいのサイズの遺伝子が各臓器で発現しているかを確認し、そのサイズからどのようなスプライシングパターンで遺伝子発現をおこなっているかを推測していく予定である。また、新たに討議されているエクソン８、９についても、ＰＣＲ法等にて検討を計画している。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	研究費の主たるものとしては、in situ hybridization法、ノーザンブロット法を施行できるような環境整備に研究費をあてていく。また、類似の方法をおこなっている研究施設でも同様な方法を施行し、客観性の高い結果が得られたかを検討していく予定である。そのため研究費のいつ部をそのような機関での研究に当てていく予定である。また最終的に学会発表、論文発表のためにも使用をおこなう予定である。