2012 Fiscal Year Research-status Report

ヌクレオホスミンにより転写後発現制御される遺伝子の軟骨における役割の解析

Research Project

Project/Area Number	23592998
Research Institution	Showa University
Principal Investigator	椋代義樹昭和大学, 歯学部, 助教 (50325099)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	新谷悟昭和大学, 歯学部, 教授 (80294429) 近藤誠二昭和大学, 歯学部, 准教授 (10432634)
Keywords	骨 / 軟骨 / ヌクレオホスミン / B23 / RNA / 3'-UTR / 転写後発現制御 / cis-elemment
Research Abstract	骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞などの骨代謝に関与する細胞の分化・増殖は多くの遺伝子によって厳格に制御されている。さらに、細胞における遺伝子の発現は、様々な段階（転写、転写後調整、翻訳、翻訳後調整など）で、様々なタンパクによって調節されていることが報告されている。細胞核内のゲノムDNAからmRNAへの転写制御機構は、軟骨細胞などを含む様々な細胞で、数多く報告されてきた。さらに、最終的な遺伝子発現は、転写以降の段階でも巧妙に制御されている。すなわち、核内あるいは細胞質におけるmRNAの輸送、安定性調節などの転写後制御および、リボゾーム（ポリゾーム）におけるタンパク-核酸複合体結合制御や翻訳制御などである。しかし、骨芽細胞や軟骨細胞などの硬組織系細胞では、この制御機構がほとんど明らかにされていない。そこで、本研究では、アフィニティクロマトグラフィー法によるNPM結合RNAの精製、およびcDNAマイクロアレイの実施準備を行った。すなわち、CMVプロモーター下流に、マウスNPMのcDNAの5’末端（アミノ酸配列のC末端）にHA抗原タグを付与したキメラタンパク質をコードする哺乳類発現ベクターを作成し、これをマウス軟骨細胞株ATDC5細胞にトランスフェクションをおこなった。48時間後に、タグ付き強制発現NPM-RNA複合体を化学的に架橋固定し、抗HA抗体で免疫沈降させる。これをプロテインGカラムに通し、塩濃度勾配法にて抗体特異的NPM-RNA複合体を溶出させる。過熱還元反応によりRNA-NPM間の架橋結合を破壊、ただちにRNAを精製し、この精製されたRNAを鋳型として、cDNAに逆転写し、次世代シークエンサーで目的のcDNAの発現を解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成24研究計画に基づいて、以下の研究を遂行した。「次世代シークエンサーにより単離されたされた遺伝子の内軟骨性骨化における軟骨細胞の増殖・分化に対するin vitroでの検討」 ATDC5細胞をインスリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウムで増殖～肥大化～終末分化軟骨細胞に分化誘導し、それぞれの分化ステージで、単離された遺伝子がどのように発現しているかをreal time RT-PCRおよび、細胞分画western blotting法で検討した。なお、骨・軟骨の増殖の検索には、MTTアッセイを用い、分化マーカーの検索には、アルカリホスファターゼ活性測定、硫酸化GAG定量などの生化学的アッセイを行った。さらに、TUNEL染色、アルカリホスファターゼ活性染色、アリザリンレッドS染色、トルイジンブルー染色などの細胞組織化学染色法も同時に行った。
Strategy for Future Research Activity	以下の研究計画を行う予定である。「 in vivoにおける検討」未成熟マウスの長官骨組織や、胎児マウスの成長板軟骨組織の切片を作成し、免疫組織化学法およびin situ hybridization法、TUNEL染色法などによって、骨形成において、単離された遺伝子がどのよう発現しているかを検索する。さらに、骨折モデルマウスを作成し、骨折の治癒過程においてのタンパクの発現および、mRNAの発現を同様に検討する。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	「今後の研究の推進方策」に則り、必要な試薬等を購入する予定である。また、大賀化機器はすでに平成23年度に購入したので、消耗品を中心に購入予定である。